Abstract:
Pilze stellen eine anpassungsfähige Gruppe von Mikroorganismen dar, die eine Vielzahl von Überlebensstrategien verfolgen. Eine besondere Gruppe bilden die Nematoden-fangenden Pilze (nematode-trapping fungi, NTF), die unter nährstoffarmen Bedingungen die Fähigkeit besitzen, von einem saprotrophen zu einem räuberischen Lebensstil zu wechseln. Kennzeichnend für diesen Übergang ist die Ausbildung spezialisierter Fallenstrukturen, mit deren Hilfe Nematoden gefangen und verdaut werden können. Die Differenzierung vegetativer Hyphen zu diesen komplexen Fangstrukturen wird durch zelluläre Signalkaskaden reguliert, wobei die Wahrnehmung von Ascarosiden, einer Gruppe von Pheromonen, die von den Nematoden sekretiert werden, eine zentrale Rolle spielt. ... mehrDer NTF Arthrobotrys flagrans bildet charakteristische ringförmige, adhäsive Fallennetzwerke aus. Die Krümmung der Hyphe zu einer geschlossenen Ringstruktur erfordert eine präzise Steuerung des polaren Wachstums. Ein zentraler Faktor ist hierbei das Zytoskelett. Experimente mit Aktin-Inhibitoren zeigten, dass eine Störung des Aktinzytoskeletts die Ringbildung verhindert und stattdessen zur Ausbildung gerader, stäbchenförmiger Strukturen führt. Polaritätsvermittelnde Proteine wie Zellendmarker sind an der Regulation des Zytoskeletts beteiligt und stellen somit potenzielle zentrale Faktoren für die morphologische Differenzierung während der Fallenbildung dar. Um die Rolle von Zellendmarkern während der Fallenbildung zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Arbeit TeaA, TeaC und TeaR charakterisiert. Es handelt sich um eine Gruppe von Proteinen, die bereits in Schizosaccharomyces pombe und in filamentösen Pilzen wie Aspergillus nidulans beschrieben wurden und die Wachstumsrichtung der Hyphen beeinflussen. Mittels GFP-Lokalisation wurde gezeigt, dass die Zellendmarker in A. flagrans an den Hyphenspitzen und Septen akkumulieren. Die Deletion von teaA oder teaC sowie die Überexpression von teaA führten zu einem Verlust der Ringkrümmung, wodurch säulenförmige Fallen entstanden. Die Deletion von teaR resultierte in Fallen mit reduziertem Durchmesser, die jedoch weiterhin Ringstrukturen ausbilden konnten. Für die Ausbildung einer geschlossenen Ringfalle muss die differenzierte Fallenhyphe mit der vegetativen Hyphe fusionieren. Während dieses Prozesses erfolgt ein Signalaustausch zwischen den fusionierenden Hyphen, der ihr gerichtetes Wachstum aufeinander koordiniert. Das in Neurospora crassa beschriebene Zelldialog-Modell erklärt diesen Vorgang durch ein oszillierendes Wechseln der Hyphen zwischen den Zuständen eines Signalsenders und eines Signalempfängers. Dabei oszilliert die Lokalisation von MAPK-assoziierten Proteinen wie SO und MAK-2 an der Hyphenspitze. Diese Proteine stehen im Zusammenhang mit der Sekretion eines Signalmoleküls, das der Informationsübertragung zwischen den Hyphen dient, dessen Identität jedoch bislang ungeklärt ist. An der Hyphenfusion sind zudem reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) beteiligt. Wird dem Medium experimentell ROS entzogen, verliert der Pilz die Fähigkeit zur Hyphenfusion. Die genaue Wirkungsweise von ROS während dieses Prozesses ist jedoch bislang nicht vollständig verstanden. In der vorliegenden Arbeit wurden die NADPH-Oxidasen NoxA und NoxB in A. flagrans charakterisiert, ebenso der Aktivator NoxR sowie das Tetraspanin PlsA, das putativ mit NoxB interagiert. Die Deletion von noxA oder noxR führte zu einem vollständigen Verlust der Hyphenfusionsfähigkeit, sodass keine geschlossenen Fallen mehr gebildet werden konnten. Dagegen zeigte die Deletion von noxB oder des putativen Interaktionspartners plsA keine Beeinträchtigung der Hyphenfusion, jedoch war die Fangeffizienz von Nematoden signifikant reduziert. Expressionsanalysen ergaben außerdem, dass noxA während der pathogenen Phase herunterreguliert ist, während noxR, noxB und plsA hochreguliert wurden. Lokalisationsstudien mit GFP-Fusion zeigten eine Membranlokalisation von NoxA im vegetativen Myzel, während NoxB und PlsA in vesikelförmigen Strukturen an der Innenseite der Fallen lokalisiert waren. NoxR wurde überwiegend an der Hyphenspitze nachgewiesen, wo es analog zu SofT (SO) und MakB (MAK-2) antiphasische Oszillationen aufwies. Die Oszillation von NoxR ist ein deutlicher Hinweis auf eine ROS-Oszillation während des polaren Wachstums von Hyphen.
Abstract (englisch):
Fungi represent a highly adaptable group of microorganisms that employ a wide range of survival strategies. A particular group is formed by the nematode-trapping fungi (NTF), which under nutrient-limited conditions possess the ability to switch from a saprotrophic to a predatory lifestyle. A characteristic feature of this transition is the formation of specialized trapping structures that enable the capture and digestion of nematodes. The differentiation of vegetative hyphae into these complex trapping structures is regulated by cellular signalling cascades, in which the perception of ascarosides, a group of pheromones secreted by nematodes, plays a central role. ... mehrThe NTF Arthrobotrys flagrans forms characteristic ring-shaped adhesive trapping networks. The bending of the hypha into a closed ring structure requires precise control of polar growth. A central factor in this process is the cytoskeleton. Experiments with actin inhibitors have shown that disruption of the actin cytoskeleton prevents ring formation and instead leads to the development of straight, rod-shaped structures. Polarity-regulating proteins such as cell-end marker proteins are involved in the regulation of the cytoskeleton and therefore represent potential key factors for morphological differentiation during trap formation. To investigate the role of cell-end marker proteins during trap formation, TeaA, TeaC, and TeaR were characterized in this study. These proteins belong to a group that has previously been described in Schizosaccharomyces pombe and in filamentous fungi such as Aspergillus nidulans, where they influence the growth direction of hyphae. GFP localization experiments demonstrated that the cell-end markers accumulate at hyphal tips and septa in A. flagrans. Deletion of teaA or teaC, as well as overexpression of teaA, resulted in a loss of ring curvature, leading to the formation of column-shaped traps. Deletion of teaR produced traps with a reduced diameter that were still able to form ring structures. For the formation of a closed ring trap, the differentiated trapping hypha must fuse with the vegetative hypha. During this process, signal exchange occurs between the fusing hyphae, coordinating their directed growth toward each other. The cell-dialogue model described in Neurospora crassa explains this process by an oscillatory switching of hyphae between the states of signal sender and signal receiver. During this process, the localization of MAPK-associated proteins such as SO and MAK-2 oscillates at the hyphal tip. These proteins are associated with the secretion of a signalling molecule that mediates information transfer between the hyphae, although its identity remains unknown. Reactive oxygen species (ROS) are also involved in hyphal fusion. When ROS are experimentally removed from the medium, the fungus loses its ability to undergo hyphal fusion.
However, the precise mechanism by which ROS function during this process is still not fully understood. In this study, the NADPH oxidases NoxA and NoxB in A. flagrans were characterized, as well as the activator NoxR and the tetraspanin PlsA, which putatively interacts with NoxB. Deletion of noxA or noxR resulted in a complete loss of hyphal fusion capability, preventing the formation of closed traps. In contrast, deletion of noxB or the putative interaction partner plsA did not impair hyphal fusion, although the trapping efficiency of nematodes was significantly reduced. Expression analyses further revealed that noxA is downregulated during the pathogenic phase, whereas noxR, noxB, and plsA are upregulated. Localization studies using GFP fusions showed membrane localization of NoxA in the vegetative mycelium, whereas NoxB and PlsA were localized in vesicle-like structures at the inner side of the traps. NoxR was predominantly detected at the hyphal tip, where it exhibited antiphase oscillations similar to SofT (SO) and MakB (MAK-2). The oscillation of NoxR provides strong evidence for ROS oscillations during the polar growth of hyphae.
