Unraveling Copper-Induced Toxicity in Lung and Liver Models in vitro: Insights from Transcriptomics, Proteomics, and Redox Biology

Kupfer (Cu) ist ein essentielles Spurenelement und findet zunehmend Anwendung in industriellen und klinischen Bereichen. Aufgrund ihrer physikochemischen Eigenschaften rücken insbesondere Cu-haltige Nanomaterialien in den Fokus, was jedoch Bedenken hinsichtlich ihrer Sicherheit für die menschliche Gesundheit aufwirft. Obwohl gezeigt wurde, dass Kupferoxid-Nanopartikel (CuO NP) toxischer sind als entsprechende Mikropartikel oder lösliche Cu-Ionen (Strauch et al., 2017), sind vergleichende Untersuchungen in organrelevanten Zellmodellen sowie zum Einfluss von Cu auf die zelluläre Redox-Regulation stark limitiert. ... mehr

In dieser Arbeit wurde die akute Toxizität nicht- oder leicht zytotoxischer Konzentrationen von CuO NP im Vergleich zu löslichen Cu-Ionen an humanen Bronchialzellen (BEAS-2B) und Hepatoblastomzellen (HepG2) untersucht. Aufnahmestudien (4-24 h) zeigten eine rapide CuO NP Aufnahme nach 4 h, während Cu-Ionen konzentrations- und zeitabhängig aufgenommen wurden. Die zelluläre Cu-Last war in HepG2 Zellen für beide Verbindungen vergleichbar, wohingegen BEAS-2B Zellen nach CuO NP Exposition bis zu 100-fach höhere Cu-Gehalte im Vergleich zu Cu-Ionen aufwiesen. Die dynaminabhängige Endozytose wurde lediglich in BEAS-2B Zellen als primärer Aufnahmemechanismus für CuO NP identifiziert. Zur mechanistischen Aufklärung der Cu-Toxizität wurden globale Transkriptomanalysen und Shotgun-Proteomics eingesetzt. Die Ergebnisse zeigten einen multifaktoriellen Wirkmechanismus der Cu-Toxizität mit Effekten auf die Transkription und Translation. Es zeigten sich signifikante Effekte auf die Metallhomöostase, die (oxidative) Stressantwort, Inflammation sowie die Redox-Regulation, wobei der NRF2-Signalweg als zentraler Angriffspunkt identifiziert wurde. Funktionelle Untersuchungen zeigten signifikante Effekte auf die Zellzyklusregulation, wobei BEAS-2B Zellen sensitiver reagierten. Eine Zunahme proinflammatorischer Zytokine trat ausschließlich in HepG2 Zellen auf. In beiden Zelllinien wurde nach 24 h kein Anstieg an reaktiven Sauerstoffspezies detektiert. Dies deutet darauf hin, dass der beobachteten oxidativen Stressantwort vorwiegend regulatorische Mechanismen zugrunde liegen. Daher wurde die reversible Cysteinoxidation als posttranslationale Modifikation untersucht. Während ein massiver, durch CuO NP induzierter Cu-Überschuss in BEAS-2B Zellen geringere Effekte auf die reversible Cysteinoxidation zeigte, führte ein moderater Cu-Anstieg durch Cu-Ionen zu ausgeprägten Veränderungen. In HepG2 Zellen waren die Effekte weniger stark ausgeprägt und es konnte kein nennenswerter Unterschied zwischen beiden Verbindungen beobachtet werden. In beiden Zelllinien erwiesen sich (mitochondriale) ribosomale Proteine als besonders sensitive Zielstrukturen.

Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die erhöhte Toxizität von CuO NP gegenüber Cu-Ionen vom Zelltyp und dem Aufnahmemechanismus abhängt. CuO NP sind vermutlich nur bei Aufnahme über den 'Trojan-horse type' Mechanismus toxischer, da dies eine massive Cu-Überladung induziert. Zudem scheinen Zinkfingerdomänen wichtige Zielstrukturen von Cu zu sein. Ferner konnte gezeigt werden, dass Proteomanalysen entscheidende mechanistische Einblicke ergänzend zu Transkriptomanalysen ermöglichen. Die Ergebnisse verdeutlichen die Bedeutung von multi-omics Methoden und den Einsatz verschiedener Organmodelle für die in vitro Forschung im Bereich der Toxikologie.

The transition metal copper (Cu) is an essential trace element for the human body and is widely used in industrial and clinical applications. In recent years, Cu-containing nanoparticles (NP) attracted considerable attention due to their favorable physicochemical properties. However, the increasing use of Cu, particularly as copper(II) oxide (CuO) nanoparticles (CuO NP), raises concerns regarding human health. CuO NP were shown to be substantially more toxic than CuO microparticles or dissolved Cu ions in lung cells (Strauch et al., 2017). Yet, mechanistic studies comparing organ-relevant cell models remain limited. ... mehrMoreover, despite the redox-active nature of Cu, its specific impact on the cellular redox regulation has not yet been systematically investigated.

This study investigated the acute toxicity of CuO NP compared to Cu ions in human epithelial bronchial (BEAS-2B) and human hepatoblastoma (HepG2) cells, applying non- or low cytotoxic concentrations in a multi-omics approach. Uptake studies (4-24 h) showed rapid internalization of CuO NP within 4 h, whereas Cu ions were taken up in a concentration- and time-dependent manner. Cellular Cu levels were comparable in HepG2 cells for both compounds, but differed markedly in BEAS-2B cells, where CuO NP exposure resulted in a two orders of magnitude higher Cu load than exposure to Cu ions. Dynamin-dependent endocytosis was identified as the primary uptake mechanism of CuO NP in BEAS-2B cells. Global transcriptomics and shotgun proteomics analysis showed that Cu induces cellular toxicity on a multifactorial basis, affecting both transcriptional and translational regulation. Broad cellular responses were observed, particularly in metal homeostasis, (oxidative) stress response, inflammation, and redox regulation. The NRF2 pathway was identified as a main target of Cu. On a functional level, Cu significantly affected cell cycle progression, with BEAS-2B cells being more susceptible than HepG2 cells, while cytokine release was significantly increased only in HepG2 cells. No significant induction of reactive oxygen species was detected after 24 h, suggesting that the observed oxidative stress response is likely based on regulatory mechanisms. Consequently, reversible cysteine oxidation was investigated as an important posttranslational modification. Interestingly, severe Cu overload induced by CuO NP in BEAS-2B cells caused fewer alterations in the reversible cysteine oxidation than moderate overload induced by Cu ions, and HepG2 cells showed less pronounced and rather compound-independent effects. In both cell lines, both Cu compounds significantly affected the reversible cysteine oxidation of (mitochondrial) ribosomal proteins, identifying thiol groups of the translational regulation as a highly sensitive target of Cu.

To conclude, the increased toxicity of CuO NP strongly depends on cell type and uptake mechanisms. CuO NP are likely more toxic than Cu ions when internalized via the Trojan-horse type mechanism, resulting in severe intracellular Cu overload. Zinc-finger domains are proposed as important target structures of Cu. While transcriptome analysis proved to be a sensitive method to study Cu toxicity, it did not necessarily predict functional outcomes, highlighting the value of additional proteomics studies to provide mechanistic insights. Overall, these findings emphasize the importance of evaluating metal toxicity across multiple organ models and underscore the value of multi-omics approaches in in vitro toxicology research.