Structure-Function Analysis of the Antimicrobial Peptide Latarcin 5

Latarcin 5 (Ltc5) ist ein 28 Aminosäuren langes, lineares, α-helikales,
amphipathisches, membranaktives Peptid aus der zentralasiatischen Spinne
Lachesana tarabaevi mit hoher antimikrobieller Aktivität und geringen
Nebenwirkungen. Ein Alanin-Scan zeigte, dass der Austausch von individuellen
Aminosäuren durch Alanin gut toleriert ist und keine nennenswerten Struktur- oder
Funktions Unterschiede verursacht. Da Struktur und Mechanismus bei antimikrobiellen
Peptiden oft korrelieren, wurde in dieser Arbeit die Sekundärstruktur und die
Orientierung von Ltc5 in Membranen aus synthetischen Lipiden untersucht um den
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Wirkmechanismus von Ltc5 nachzuvollziehen. Eine hochpräzise Bestimmung von
Orientierung und Dynamik gelang mittels einer Festphasen-2H-NMR-Analyse in
vollständig hydrierten Lipid Doppelschichten. Diese ergab, dass Ltc5 eine nahezu
durchgängige α-Helix mit N- und C-Terminalem Abschnitt bildet, die nahezu identische
Helix Neigungswinkel τ (86° N-Terminus, 85° C-Terminus), aber deutlich
unterschiedlichen azimutalen Rotationswinkel ρ (99° N-Terminus, 85° C-Terminus)
aufweisen. Beide Helix Segmente zeigen wenig Mobilität im Neigungs- sowie im
Rotations-Winkel. Die α-Helix liegt flach auf der Membran wobei der Hydrophobe
Sektor von Ltc5 in Richtung des hydrophoben Kerns der Membran orientiert ist.
NMR-Messungen in Membranen unterschiedlicher Dicke und bei variierenden
Peptidkonzentrationen zeigten zudem eine weitgehende Unabhängigkeit der Helix
Orientierung von beiden Faktoren. Daher wird der oberflächengebundene S-state als
membranaktive Orientierung von Ltc5 angenommen. Weitere Experimente zeigten,
dass die Hydrophobizität für die Aktivität wichtiger ist als die spezifische Chemie der
in der Primärsequenz von Ltc5 häufig vorkommenden aromatischen Aminosäuren.
Dennoch dürften aromatische Reste aufgrund ihrer spezifischen physikalischen
Eigenschaften zu einer spezifischen Peptid-Membran Interaktion beitragen, die
evolutionär an die natürlichen Ansprüche an die Funktion von Ltc5 angepasst ist. Das
gehäufte Auftreten hydrophober Reste am N-Terminus in Ltc5 scheint besonders für
die initiale Membranbindung relevant zu sein. Eine systematische N-terminale
Verkürzung veränderte die Aktivität des Peptids deutlich. So konnte ein neues AMP,
Ltc5 5-28, mit starker Selektivität gegen Gram-positive Bakterien und minimalen
hämolytischen Nebenwirkungen identifiziert werden. In weiteren Experimenten
konnten membrandepolarisierende Effekte in E. coli, induziert durch Ltc5,
nachgewiesen werden. Diese treten ohne nennenswerte Membranschäden auf. Als
möglicher Mechanismus konnte mittels kalorimetrischer Messungen die Formation von
anionischen “Lipid-Clustern“ durch Ltc5 nachgewiesen werden. Neben den oben
genannten Mechanismen liegt auch ein intrazellulärer Wirkmechanismus als
Bestandteil des Wirkspektrums von Ltc5 weiterhin im Bereich des Möglichen.

Latarcin 5 (Ltc5) is a 28-amino-acid-long, linear, α-helical, amphipathic, membrane-active peptide derived from the Central Asian spider Lachesana tarabaevi. It exhibits potent antimicrobial activity while displaying only limited adverse effects. An alanine scan demonstrated that the substitution of individual amino acid residues with alanine is generally well tolerated and does not result in substantial structural or functional alterations.

Because the structure and mechanism of action of antimicrobial peptides are often closely correlated, the present study investigated the secondary structure and membrane orientation of Ltc5 in synthetic lipid bilayers in order to elucidate its mode of action. ... mehrHigh-precision determination of peptide orientation and dynamics was achieved by solid-state ^2H NMR spectroscopy in fully hydrated lipid bilayers. The analysis revealed that Ltc5 adopts an almost continuous α-helical conformation comprising N- and C-terminal helical segments. These segments exhibit nearly identical helix tilt angles, τ (86° for the N-terminal segment and 85° for the C-terminal segment), but markedly different azimuthal rotational angles, ρ (99° and 85°, respectively). Both helical segments show only limited mobility with respect to both tilt and rotational orientation.

The α-helix lies approximately parallel to the membrane surface, with the hydrophobic sector of Ltc5 oriented towards the hydrophobic core of the bilayer. NMR measurements performed in membranes of different thicknesses and at varying peptide concentrations further demonstrated that the helical orientation is largely independent of both parameters. Accordingly, the surface-bound S-state is proposed to represent the membrane-active orientation of Ltc5.

Additional experiments indicated that overall hydrophobicity is more important for antimicrobial activity than the specific chemical properties of the aromatic amino acids that occur frequently in the primary sequence of Ltc5. Nevertheless, owing to their distinct physicochemical properties, aromatic residues are likely to contribute to specific peptide, membrane interactions that may have been evolutionarily adapted to the physiological requirements of Ltc5 function. The pronounced accumulation of hydrophobic residues at the N-terminus of Ltc5 appears to be particularly relevant for the initial association with the membrane. Systematic N-terminal truncation substantially altered peptide activity and led to the identification of a novel antimicrobial peptide, Ltc5 5–28, which exhibits pronounced selectivity towards Gram-positive bacteria while causing minimal haemolytic effects.

Further experiments demonstrated that Ltc5 induces membrane depolarization in Escherichia coli without causing substantial membrane damage. Calorimetric measurements identified the Ltc5-induced formation of anionic lipid clusters as one possible mechanism underlying this effect. In addition to the membrane-associated mechanisms described above, an intracellular mode of action may also contribute to the overall antimicrobial activity of Ltc5 and therefore remains a plausible component of its mechanistic spectrum.