From Straw to Oil : A Biological Upcycling Process

Die Erschließung hemi- und lignocellulosehaltiger Reststoffe ist ein zentraler Schritt auf dem Weg zu einer zirkulären Bioökonomie. Ihre biotechnologische Nutzung wird bislang jedoch durch die hohe strukturelle Stabilität der Biomasse, den Aufwand konventioneller Vorbehandlungen und die begrenzte Wirtschaftlichkeit vieler nachgeschalteter Prozesse erschwert. Vor diesem Hintergrund verfolgt die vorliegende Arbeit ein zweistufiges Upcycling-Konzept: Im ersten Schritt werden pflanzliche Reststoffe mithilfe anaerober Darmpilze (AGF) in Wasserstoff und lösliche Fermentationsprodukte überführt; im zweiten Schritt dienen diese Produkte als Ausgangsbasis für die Lipidbildung in oleogenen Hefen.
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Als Grundlage der ersten Prozessstufe wurden sechs AGF-Stämme – Aestipascuomyces dupliciliberans, Caecomyces churrovis, Khoyollomyces ramosus, Orpinomyces joyonii, Pecoramyces ruminantium und Neocallimastix cameroonii – systematisch hinsichtlich Kultivierbarkeit, Substratnutzung und Metabolitbildung untersucht. Die höchste metabolische Gesamtaktivität wurde bei den meisten Stämmen bei etwa 39 °C beobachtet, während die Temperaturoptima der Wasserstoffbildung stammspezifisch waren und bis 41 °C reichten. Gröbere Weizenstrohfraktionen förderten die Wasserstoffproduktion teilweise, und insbesondere Glukose sowie Cellobiose wurden effizient umgesetzt. Xylose führte dagegen bei mehreren Stämmen zu einem stressassoziierten Stoffwechsel mit geringer Wasserstoffbildung. Mit steigender Zuckerkonzentration verschob sich der Stoffwechsel reproduzierbar in Richtung Overflow-Metabolismus, was sich in erhöhten Lactat- und Formiatmengen zeigte. Eine Fed-Batch-Führung verbesserte die Gesamtleistung nicht, was darauf hindeutet, dass die Grenzen des Systems eher in der Physiologie der Pilze als in der bloßen Substratversorgung liegen. Darüber hinaus erwiesen sich verschiedene niedrigpreisige Reststoffe, insbesondere Gurken-, Karotten- und Kartoffelschalen, als gut verwertbare Substrate. Zusätzlich wurde bei O. joyonii während längerer Kultivierung auf löslichen Kohlenstoffquellen eine bislang nicht beschriebene, offenbar stressinduzierte Wachstumsform beobachtet.
Um die grundlegenden Anforderungen an die Kultivierung anaerober Darmpilze besser zu verstehen, wurde das klassische CO₂/HCO₃⁻-System der Serumflaschenkultivierung gezielt entkoppelt. Dabei wurden Gasatmosphäre, Puffersystem, Bicarbonatversorgung, pH-Wert und Stickstoffangebot unabhängig voneinander untersucht. Der Ersatz von CO₂ durch N₂ steigerte die Wasserstoffbildung, während Medien ohne Bicarbonat trotz stabilem externem pH-Wert kein dauerhaftes Wachstum ermöglichten. Bicarbonat übernimmt damit für AGF offenbar mehr als eine reine Pufferfunktion. Erst die erneute Zugabe von NaHCO₃ stellte das Wachstum wieder her, und zwar bereits bei niedrigen, jedoch stammabhängigen Schwellenkonzentrationen; alternative Carbonsäuren konnten diese Funktion nicht ersetzen. Unter definierten Bedingungen lag die höchste metabolische Aktivität bei pH 6,4. Ergänzend wurde eine OD₇₅₀-basierte Methode zur Biomassebestimmung etabliert, die auch für filamentöse Kulturen eine übertragbare Quantifizierung ermöglicht. Bioelektrochemische Untersuchungen zeigten zudem, dass die in früheren AGF-Fermentationen beobachteten Elektronenlücken nicht allein durch redoxaktive Medienkomponenten erklärbar sind. Ferricyanid erzeugte reproduzierbare, pilzabhängige Stromsignale und lieferte damit den ersten experimentellen Hinweis auf eine vermittelte extrazelluläre Elektronenübertragung bei einem anaeroben Darmpilz. Insgesamt definiert die Arbeit damit den physiologischen und prozesstechnischen Rahmen, in dem AGF als primäre Biokatalysatoren für die Lignocelluloseverwertung eingesetzt werden können. Für die zweite Prozessstufe wurden vier oleogene Hefen, Cutaneotrichosporon oleaginosum, Saitozyma podzolica, Scheffersomyces segobiensis und Apiotrichum porosum im 2,5-L-Rührkesselbioreaktor unter Stickstofflimitierung, Phosphatlimitierung und nährstoffreichen Bedingungen verglichen. Die höchsten absoluten Lipidtiter wurden unter Stickstofflimitierung erreicht und lagen bei bis zu 9,2 g L⁻¹. Die Phosphatlimitierung führte zwar zu geringerer Biomassebildung, ermöglichte jedoch mit bis zu 0,0037 g gCDW⁻¹ h⁻¹ bei S. podzolica die höchste spezifische Lipidbildungsrate und stellt damit eine interessante Alternative für stickstoffreiche Einsatzsubstrate dar. Um die wirtschaftliche Relevanz der Hefeplattform zu erhöhen, wurde außerdem unbehandeltes industrielles Rohglycerin als alleinige Kohlenstoffquelle für C. oleaginosum untersucht. Eine direkte Batch-Kultivierung führte zu vollständigem Wachstumsstillstand und bestätigte damit die starke Inhibition in der frühen Prozessphase. Durch eine schrittweise Fütterungsstrategie konnte die inhibitorische Belastung pro vorhandener Biomasse jedoch gezielt reduziert werden, sodass Wachstum, respirative Aktivität und Lipidakkumulation unter diesen Bedingungen möglich waren. Im 2,5-L-Maßstab wurden scheinbare Wachstumsraten von bis zu 0,51 h⁻¹ und Volumenproduktivitäten von bis zu 0,22 g L⁻¹ h⁻¹ erreicht; die Lipidgehalte lagen bei rund 30 % der Zelltrockenmasse, und die Fettsäureprofile waren durch hohe Ölsäureanteile geprägt. Auch im 19-L-Repeated-Batch-Betrieb über mehr als 640 Stunden blieb das Verfahren trotz deutlicher Chargenschwankungen des Substrats stabil; Lipidgehalte von etwa 30–36 % bei der getrockneten Biomasse und Ölsäureanteile von rund 51–53 % des Ölgehaltes blieben erhalten.
Da repräsentative AGF-Metabolitmischungen das Wachstum des Wildtyps von C. oleaginosum, insbesondere aufgrund von Formiat, deutlich einschränkten, wurde zur Verbesserung der Systemkompatibilität eine mikrofluidische adaptive Laborevolution ohne gentechnische Eingriffe durchgeführt. Die erfolgreichsten adaptierten Isolate zeigten nicht nur ein verbessertes Wachstum, sondern auch eine signifikant gesteigerte Aufnahme von Ethanol, Lactat und Formiat. Damit konnte gezeigt werden, dass sich die Robustheit des nachgeschalteten Organismus gegenüber komplexen und inhibitorischen Pilzmetabolitmischungen gezielt erhöhen lässt. Abschließend wurde die direkte Verknüpfung beider biologischer Plattformen in einer konsekutiven Kultivierung untersucht. Dabei zeigte sich, dass die praktische Kopplung deutlich anspruchsvoller ist als zunächst erwartet: Zwar stellen die von anaeroben Pilzen gebildeten Metabolite grundsätzlich eine vielversprechende Kohlenstoffplattform dar, ihre unmittelbare Nutzung wurde jedoch durch einen unerwarteten inhibitorischen Effekt erschwert. Die bisherigen Befunde sprechen dafür, dass ein toxischer Faktor intrazellulär gebildet und anschließend freigesetzt wird, sodass derzeit eine Verdünnung der Fermentationsbrühe erforderlich ist, um nachgeschaltetes Wachstum zu ermöglichen. Insgesamt zeigt die Arbeit damit nicht nur das Potenzial eines „straw-to-oil“-Ansatzes, sondern identifiziert zugleich eine zentrale Kompatibilitätsgrenze, die für die zukünftige Umsetzung eines integrierten Prozesses gezielt adressiert werden muss.

Utilization of hemi- and lignocellulosic side streams will be essential for the transition from a fossil-based to a circular bioeconomy. However, the direct biotechnological use of such materials remains limited by structural recalcitrance, the need for energy-intensive pretreatment, and the low economic robustness of many downstream conversion routes.
This dissertation addresses these limitations by investigating a two-stage upcycling concept in which anaerobic gut fungi (AGF) first convert untreated plant biomass into hydrogen and reduced fermentation intermediates, which are subsequently upgraded to microbial lipids by oleaginous yeasts. ... mehrTo establish the upstream platform, six AGF strains, Aestipascuomyces dupliciliberans, Caecomyces churrovis, Khoyollomyces ramosus, Orpinomyces joyonii, Pecoramyces ruminantium, and Neocallimastix cameroonii, were systematically characterized with respect to cultivation robustness, substrate utilization, and metabolic output. Across strains, overall activity was generally highest around 39 °C, whereas hydrogen production optima were strain-specific and reached up to 41 °C. Larger wheat straw particles partly enhanced hydrogen formation, while glucose and cellobiose were readily metabolized. By contrast, xylose induced stress-associated responses and poor hydrogen production in several strains. Increasing sugar concentrations triggered a reproducible shift toward overflow metabolism, reflected in elevated lactate and formate formation, whereas fed-batch cultivation did not improve total metabolite formation, indicating that process performance was constrained by physiological rather than simple substrate-supply limitations. In addition, several low-value biowastes, particularly cucumber, carrot, and potato peel residues, supported efficient growth and degradation, and a previously undescribed stress-associated growth form of O. joyonii was observed under prolonged cultivation on soluble substrates. To clarify fundamental cultivation requirements, the classical CO₂/HCO₃⁻ buffer system was deconvoluted by independently varying gas atmosphere, buffering chemistry, bicarbonate supply, pH, and nitrogen availability. Replacement of CO₂ with N₂ increased hydrogen production, whereas bicarbonate-free media failed to sustain growth despite stable external pH, demonstrating that bicarbonate is required beyond its function as an extracellular buffer. Reintroduction of NaHCO₃ restored growth at low, strain-specific threshold concentrations, alternative carboxylic acids did not substitute for bicarbonate, and maximal activity under defined conditions was observed at pH 6.4. An OD₇₅₀-based biomass quantification method further enabled transferable growth assessment in filamentous cultures. Bioelectrochemical screening revealed that historical electron-recovery deficits in AGF fermentations cannot be explained by medium-derived redox-active compounds alone; ferricyanide supported reproducible fungus-dependent current generation, providing the first experimental evidence for mediated extracellular electron transfer in an anaerobic gut fungus. Together, these results define the cultivation and metabolic framework required to use AGF as robust primary biocatalysts for lignocellulosic conversion. To establish the downstream upgrading platform, four oleaginous yeasts, Cutaneotrichosporon oleaginosum, Saitozyma podzolica, Scheffersomyces segobiensis, and Apiotrichum porosum, were benchmarked in 2.5 L stirred-tank reactors under nitrogen-limited, phosphate-limited, and nutrient-replete conditions. Nitrogen limitation produced the highest lipid titres, reaching up to 9.2 g L⁻¹, whereas phosphate limitation reduced biomass formation but yielded the highest specific lipid production rate, up to 0.0037 g gCDW⁻¹ h⁻¹ in S. podzolica, thereby identifying phosphate limitation as a process-relevant alternative for nitrogen-rich substrates. To improve substrate realism and economic relevance, untreated industrial crude glycerol was evaluated as sole carbon source for C. oleaginosum. Direct batch cultivation caused complete growth arrest, confirming severe early-phase inhibition by impurities. However, a simple stepwise feeding strategy reduced the inhibitor-to-biomass ratio during early growth and restored biomass formation, respiration, and lipid accumulation. At 2.5 L scale, apparent growth rates up to 0.51 h⁻¹ and volumetric productivities up to 0.22 g L⁻¹ h⁻¹ were achieved, with lipid contents around 30% of cell dry weight and oleate-dominated fatty acid profiles. The process remained stable after transition to 19 L repeated-batch cultivation for more than 640 h, maintaining lipid contents of approximately 30–36% and oleate fractions of about 51–53% despite marked substrate-batch variability.
Finally, because representative AGF metabolite mixtures strongly impaired the growth of wild-type C. oleaginosum, especially in the presence of formate, a microfluidic adaptive laboratory evolution strategy was implemented to improve downstream compatibility without genetic engineering. The best evolved isolates exhibited improved growth and significantly enhanced uptake of ethanol, lactate, and formate, demonstrating that physiological adaptation can substantially increase robustness toward complex, inhibitor-rich fungal metabolite mixtures. In a final step, the practical feasibility of directly linking both biological platforms was assessed in a consecutive cultivation concept. These preliminary coupling experiments showed that the integration of anaerobic fungal fermentation broths with oleaginous yeast cultivation is more challenging than initially anticipated. Although the fungal metabolites constitute a promising carbon platform in principle, direct downstream utilization was hindered by an unexpected inhibitory effect, indicating the presence of a toxic factor in the fungal broth. Based on the current observations, this inhibition is consistent with a compound that is likely formed intracellularly and subsequently released, thereby impairing downstream growth unless the broth is diluted. These findings highlight that successful coupling will not depend solely on matching carbon sources and product spectra, but also on controlling inhibitory broth components and establishing suitable conditioning or dilution strategies. Thus, the final outcome of this work is not only the demonstration of the biological potential of a “straw-to-oil” concept, but also the identification of a critical compatibility barrier that must be overcome for future implementation of an integrated process.