Signaltransduktionsmechanismen in der Kolonkarzinomzelllinie HT-29 nach Behandlung mit Fermentationslösungen funktioneller Kohlenhydrate sowie Gemischen kurzkettiger Fettsäuren [online]

Zusammenfassung

Neuartigen, funktionellen Kohlenhydraten wird eine große
Bedeutung bei der Prävention kolorektaler Karzinome beigemessen.
Die Wirkung auf das Kolonepithel wird dabei von den aus ihrer
Fermentation resultierenden kurzkettigen Fettsäuren (SCFA)
vermittelt. Diesen SCFA werden Effekte in verschiedenen
Abschnitten der Zellzykluskontrolle, der Proliferation und der
Apoptose zugesprochen. Die zugrundeliegenden intrazellulären
Mechanismen der Signaltransduktion, über die präventive Effekte
moduliert werden können sind dabei von besonderer Bedeutung.
In dieser Arbeit wurde mittels Mikrospektrofluorimetrie
untersucht, welche Effekte invitro-Fermentationslösungen (FÜ)
und äquimolare SCFA-Gemische auf den intrazellulären pH-Wert
(pHi) und die damit eng verbundene intrazelluläre
Kalziumkonzentration ([Ca2+]i) der Kolonkarzinomzelllinie HT-29
ausüben.
Es zeigte sich, dass die FÜ ihre Wirkung zunächst über eine
Alkalisierung des pHi und eine damit verbundene Erhöhung der
[Ca2+]i vermitteln. Die sich anschließende starke
Azidifizierung des Zytoplasmas führte zu einer Erniedrigung der
[Ca2+]i. Diese war unabhängig von der Inhibitio ... mehrn des
Na+/H+-Austauschers durch EIPA. Der SCFAinduzierte, langsame
Anstieg der [Ca2+]i war zeitlich mit der Azidifizierung des
Zytoplasmas verbunden. Eine Inkubation mit EIPA konnte die
Regulation des pHi nach der Azidifizierung völlig inhibieren,
die Veränderungen der [Ca2+]i blieben davon jedoch
unbeeinflusst. Nach Beenden der Superfusion der Zellen mit den
SCFAGemischen, traten charakteristische „overshoots“ des pHi als
auch der [Ca2+]i auf. Diese wurden durch die Verwendung des
Komplexbildners EGTA unterbunden. Die Erhöhung der [Ca2+]i
konnte sowohl bei den FÜ als auch den SCFA-Gemischen nach
Kontrollversuchen mit EGTA auf einen Einstrom extrazellulär
vorhandener Ca2+-Ionen zurückgeführt werden. Die stark
divergierenden Antwortmuster der HT-29-Zellen auf die FÜ,
respektive die SCFA-Gemische, wurden mit dem Ammoniumgehalt der
FÜ in Zusammenhang gebracht.
Im zweiten Teil der Arbeit konnte anhand molekularbiologischer
Untersuchungen mit der Einzelfettsäure Butyrat mögliche
Signalwege charakterisiert werden, die nach den Veränderungen
von pHi und [Ca2+]i an der Signalweiterleitung beteiligt sein
können.
Hierzu wurden die Signalwege der MAP-Kinasen p38 und SAPK/JNK
untersucht.
Während die p38-Kinase durch eine Butyratinkubation nicht
phosphoryliert werden konnte, induzierte eine 8-stündige
Behandlung mit 3 mmol/L Butyrat die Aktivierung von SAPK/JNK.
Des weiteren wurden sieben Gene, die an der Zellzykluskontrolle,
Proliferation bzw. Apoptoseinduktion beteiligt sind mittels
RT-PCR und Gelelektrophorese auf ihre Expression nach
Butyratbehandlung untersucht. Während die mRNA-Spiegel von
c-myc, Cox-1, Cox-2 und NF-κB durch 3 mmol/L Butyrat bei keiner
der Inkubationszeiten signifikant beeinflusst wurden, konnte
eine signifikante Reduktion der exprimierten mRNA-Menge des
Transkriptionsfaktors PCNA nach 24-stündiger Behandlungszeit
nachgewiesen werden. Für Bax wurde tendenziell eine erhöhte
Expressionsrate an mRNA nach 1-, 3- bzw. 24-stündiger
Behandlungszeit beobachtet, die jedoch nicht signifikant war.
Für das Bcl-2 konnten nach der Elektrophorese keine Transkripte
nachgewiesen werden, was darauf hindeutet, dass das Gen in
HT-29-Zellen nicht exprimiert wird.
Die Ergebnisse der Untersuchungen weisen darauf hin, dass die
präventiven Eigenschaften von Butyrat auf die Karzinogenese über
den Signalweg der MAP-Kinase SAPK/JNK vermittelt werden könnte.
An der Signaltransduktion ist der Transkriptionsfaktor PCNA
beteiligt, auch für das pro-apoptotische Bax ist eine
Beteiligung in Betracht zu ziehen.
Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse zeigen, dass
sowohl die Fermentationsüberstände als auch die kurzkettigen
Fettsäuren Effekte auf verschiedene frühe Mechanismen der
Signaltransduktion in HT-29-Zellen ausüben. Der Beitrag zur
Beeinflussung der Promotion bzw. Progression der Karzinogenese
muss jedoch weiter kontrovers diskutiert werden.