Biochemische Wirkungen von organischen Metallverbindungen auf in vitro Zellsysteme: Untersuchungen zur zellulären Signaltransduktion und Apoptose

In der vorliegenden Arbeit wurden intrazelluläre Signaltransduktionsmechanismen unter dem Einfluß von organischen Zinnverbindungen untersucht. Als Modellsubstanz wurde hier die für die Umwelt relevanteste Verbindung Tributylzinn (TBT) verwendet. Die TBT-induzierte Arachidonsäurefreisetzung wurde untersucht und der hierfür verantwortliche Mechanismus aufgeklärt: TBT induziert über die Aktivierung der zytosolischen Phospholipase A2 (cPLA2) die Freisetzung von Arachidonsäure.
Anschließend wurde die Reaktionsfolge, die zur Aktivierung der cPLA2 führte, näher charakterisiert. ... mehrDie Behandlung mit TBT induzierte über eine sehr schnelle Aktivierung der MAP Kinase Kaskade die Phosphorylierung der cPLA2 und schließlich die Freisetzung von Arachidonsäure. Diese Ergebnisse waren bei HL-60 Zellen, P388D1 Zellen und HeLa Zellen identisch. TBT stimulierte außerdem die Aktivität der c-Jun NH2-terminalen Kinase (JNK).
In dieser Arbeit wurde damit erstmals die Aktivierung verschiedener Proteinkinasen durch organische Metallverbindungen nachgewiesen. Damit kommt zur bereits bekannten Störung der intrazellulären Calciumhomöostase durch organische Metallverbindungen ein neuer Wirkungsmechanismus hinzu, der die calcium-abhängigen Effekte noch verstärken kann. Versuche mit Calciumchelatoren bewiesen, daß für die TBT-induzierte Aktivierung der Proteinkinasen eine intrazelluläre Calciumerhöhung zwar essentiell aber allein nicht ausreichend ist.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden Untersuchungen zur induzierten Apoptose durchgeführt. Hierbei stand die Untersuchung spezifischer morphologischer Veränderungen, der Fragmentierung der DNA und proteolytischer Prozesse im Vordergrund. Mit verschiedenen mikroskopischen und biochemischen Techniken wurde der organometall-induzierte Zelltod eindeutig als Apoptose charakterisiert. Die Apoptose wurde innerhalb weniger Stunden induziert, und auch hier waren die Effekte von TBT vom untersuchten Zelltyp unabhängig.
Die Aktivierung von Caspasen und Endonukleasen ist verantwortlich für die spezifischen Abbauprozesse nach Behandlung mit TBT. Der Beweis hierfür wurde durch die Vorbehandlung mit Capase Inhibitoren erbracht. Dies führte zur Aufhebung der metall-induzierten Effekte auf allen Ebenen.
Die Inkubation mit apoptose-induzierenden Konzentrationen von TBT führte zur Aktivierung von Kinasen aus der MAP Kinase Familie. Durch Verwendung von spezifischen Kinase Inhibitoren wurde ein Zusammenhang zwischen der Aktivierung von Proteinkinasen und der Induktion der Apoptose hergestellt.
Die im Rahmen dieser Arbeit nachgewiesene Induktion der Apoptose durch Organometalle könnte für die bereits beschriebenen immunotoxischen und neurotoxischen aber auch die antiproliferativen Effekte einiger Verbindungen verantwortlich sein. Die hier beschriebene Vielfalt der durch organische Metallverbindungen induzierten tiefgreifenden Reaktionen, führte im Hinblick auf die bereits nachgewiesenen Konzentrationen in der Umwelt zu dem Schluß, daß die weitere Verwendung und Zulassung dieser Verbindungsklasse in Zukunft äußerst kritisch überdacht werden sollte.

Biochemical effects of organometal compounds on in vitro cell systems: investigations on cellular signal transduction and apoptosis
In the present study, the effects of organic tin compounds on intracellular signal transduction pathways have been investigated. Tributyltin (TBT) which served as a model substance is not only the most toxic but also the most relevant organotin compound with regard to environmental pollution. The TBT-induced release of arachidonic acid was studied and the responsible mechanism was elucidated. TBT induces the activation of a cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) which finally leads to liberation of arachidonic acid.
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The reaction sequence leading to activation of the cPLA2 was also characterised. Treatment with TBT induced the phosphorylation of cPLA2 via a rapid activation of the MAP kinase cascade. The effects of TBT were not restricted to a single cell system, as similar results were obtained in HL-60, P388D1 and HeLa cells. Furthermore, TBT stimulated the activity of the c-Jun NH2-terminal kinase.
It was demonstrated for the first time that treatment of cells with organic metal compounds leads to an activation of different protein kinases. Thus, an additional mechanism of action besides the well-known disturbance of intracellular calcium homeostasis was found which could contribute to an amplification of calcium-dependent effects induced by organometals. Experiments using calcium chelators have shown that an increase in intracellular calcium concentration is essential but not sufficient for the activation of protein kinases.
In the second part of the thesis the organometal-induced cell death was investigated, with special attention to morphological changes, DNA fragmentation and proteolytic degradation processes. Using different microscopical and biochemical techniques cell death was identified unequivocally as apoptosis. After treatment with TBT apoptosis was induced within hours and was again not dependent on the cell system investigated.
The activation of caspases and endonucleases is responsible for the highly specific degradation processes observed after treatment with TBT. This was demonstrated by pretreatment with specific caspase inhibitors which led to an inhibition of TBT-induced effects.
The incubation of HL-60 cells with apoptosis-inducing concentrations of TBT also led to an activation of members of the MAP kinase family. Experiments with specific kinase inhibitors led to the assumption that apoptosis is connected with activation of these kinases.
The induction of apoptosis by organometals may be the explanation of the described immuno- and neurotoxic as well as the antiproliferative effects of some of these compounds. The observed variety of effects and the fundamental changes induced by organic metal compounds with regard to detected environmental concentrations leads to the conclusion that the further application of these substances should be reflected extremely critical.