Untersuchungen zur Stabilisierung und Miniaturisierung kationensensitiver Schichten für die Entwicklung von optochemischen Mikrosensoren

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden optochemische Sensoren (Optroden) zur Detektion der kationischen Spezies Quecksilber(II), Calcium(II) und zur Bestimmung von pH-Werten entwickelt und miniaturisiert.
Der erste thematische Schwerpunkt der Arbeit widmet sich der Verbesserung der Stabilität von kationensensitiven Rezeptorschichten. Werden diese durch einfache Einkapselung von Indikatoren hergestellt, so wird die Stabilität der Schicht bedingt durch das Auswaschen des Farbstoffes auf etwa einen Tag begrenzt. Zur Unterdrückung dieses Farbstoffaustrages wurde eine neue Immobilisierungsmethode entwickelt und erprobt, die in der kovalenten Anbindung von Fluoreszenzindikatoren an das wasserlösliche Polysaccharid Dextran (70.000 g/mol) und der anschließenden Einkapselung der makromolekular gebundenen Indikatormoleküle in hydrophilen Matrices besteht. ... mehrAls Matrices wurden anorganische Silikagele, die nach dem Sol-Gel-Verfahren hergestellt wurden, und das organische Hydrogel Polyhydroxyethylmethacrylat (PolyHEMA) eingesetzt. Die vorgestellte Immobilisierungsmethode weist gegenüber der direkten kovalenten Anbindung des Indikators an die Matrix eine deutlich erhöhte Flexibilität auf, was beispielhaft an drei Analyt-Rezeptor-Paaren dargestellt wird.
Zur Herstellung von Quecksilber-sensitiven Schichten wurden zunächst Porphyrin-Dextrane synthetisiert und mittels spektroskopischer Methoden sowie durch Elektrophorese charakterisiert. Porphyrin-Dextran-dotierte, mesoporöse Silikagel- Schichten zeigten nach 40tägiger Lagerung in Meßpuffer noch 92% der anfänglichen Fluoreszenzintensität.
Auf der Basis von Fluorescein-Dextran wurden pH-sensitive Silikagel- und PolyHEMA-Schichten hergestellt. Letztere zeigten einen Meßbereich von pH 5 bis 8 und Ansprechzeiten von 5 Sekunden/pH. Nach 18tägiger Lagerung in Meßpuffer zeigten die Sensoren noch über 95% der ursprünglichen Fluoreszenzintensitäten.
Durch Coimmobilisierung von Calcium Green-Dextran und Texas Red-Dextran wurde ein Calcium-sensitiver Sensor mit interner Referenz hergestellt. Der Meßbereich des Sensors liegt zwischen 5  10-8 und 10-5 mol/l Ca(II) bei Ansprechzeiten von 5 Sekunden bis zum Erreichen des Sättigungswertes. Der Sensor erwies sich als sehr selektiv gegenüber Interferenzen von Na(I), K(I) und Mg(II). Durch die interne Referenzierung des Meßsignals läßt sich die Reproduzierbarkeit der Sensorsignale entscheidend verbessern.
Als zweiter Schwerpunkt der Arbeit wurde in mehreren Schritten die Miniaturisierung der Calciumsensoren mit interner Referenz vorgenommen. Unter Verwendung von optischer Fasertechnik wurden Mikrosensoren mit Durchmessern von 600 bzw. 50 µm entwickelt. Basierend auf verjüngten Faserspitzen (Taper) mit Durchmessern von etwa 300 nm wurden die derzeit kleinsten faseroptischen Calciumsensoren (Nanosensoren) erhalten.
Aufgrund der verbesserten Stabilität und der extremen Miniaturisierung der vorgestellten optischen Sensoren lassen sich in Zukunft neue analytische Aufgabenstellungen (z.B. Messung in biologischen Zellen) mit einer Ortsauflösung im Nanometerbereich bearbeiten.

Investigations on stabilisation and miniaturization of cation-sensitive films for the developement of optochemical microsensors
Optochemical sensors (optrodes) for the detection of mercury(II), calcium(II) and pH were developed and miniaturized.
Initially, the stability of cation-sensitive films had to be improved. Since the stability of films prepared by simple encapsulation of the dye was limited to one day, a new immobilisation method had to be developed to reduce the wash-out (leaching) of the dye. It consists of the covalent binding of a fluorescence indicator to the water-soluble polysaccharide dextran (70.000 g/mol) followed by the encapsulation of the dye-labeled macromolecule in a hydrophilic polymer matrix. ... mehrInorganic silica gel, which was prepared by the sol-gel process, and the organic hydrogel polyhydroxymethylmethacrylat (polyHEMA) were used as matrix. The main advantage of the immobilisation method presented compared with direct covalent binding to the matrix is the variability, as shown in three examples.
Porphyrin-dextrans were synthesized and characterized spectroscopically and by electrophoresis. Sensors prepared by entrapment of porphyrin-dextran in mesoporous silica gel films were mercury-sensitive and still showed 92 % of the initial fluorescence intensity after 40 days storage in buffer.
The immobilisation of fluorescein-dextran in silica gel and polyHEMA films resulted in sensors for pH with a dynamic range from pH 5 to 8 and response times of about 5 seconds per pH. After 18 days storage in buffer, the sensors showed over 95 % of the initial signal.
Calcium Green-dextran and Texas Red-dextran were coimmobilized to make a calcium sensor with reference dye. The dynamic range of the sensor was between 5  10-8 and 10-5 mol/l Ca(II). The sensor showed a response time of 5 seconds and high selectivity with respect to interference from Na(I), K(I) and Mg(II). The reproducibility of the sensor signals was improved markedly by using a reference wavelength.
A second focus of the presented investigation was the step-by-step miniaturization of the calcium sensor with reference dye. Optical fiber technology was used to develope calcium microsensors with diameters of 600 and 50 µm, and a tapered fiber-based nanosensor with a diameter of around 300 nm, the latter being the smallest optochemical calcium sensor yet reported.
In summary, it may be said that improved stability and extreme miniaturization may enable optochemical sensors to perform new analytical tasks (e.g. measurements in biological cells) with a spatial resolution in the nanometer scale.