Divalent cations stimulate DNA repair activities of bacterial (6-4) photolyases

Die (6-4) Photolyasen der bakteriellen Cryptochrom/Photolyase (BCP) -Gruppe gehören zu einer Familie von Flavoproteinen, die als Reparaturenzyme für UV-B-induzierte DNA-Läsionen (Photolyasen) oder als Blaulicht-Photorezeptoren (Cryptochrome) fungieren. Die (6-4) BCP-Proteine kommen ausschließlich in Prokaryoten vor.
In dieser Arbeit wurden 3 Mitglieder der (6-4) BCP-Gruppe, PhrB von Agrobacterium fabrum, CryB von Rhodobacter sphaeroides und Proma-PL von Prochlorococcus marinus mit einer eukaryotischen (6-4) Photolyase von Ostreococcus tauri OtCPF1 und einem Mitglied der Klasse III CPD Photolyasen PhrA von Agrobacterium fabrum verglichen. ... mehrEs zeigte sich, dass die DNA-Reparatur-Effizienz von (6-4) BCP-Proteinen durch Mg2+ oder andere zweiwertige Kationen stimuliert wird, während bei OtCPF1 und PhrA keine Wirkung von zweiwertigen Kationen beobachtet wurde.
Der Einfluss zweiwertiger Kationen auf die Photoreduktion bei verschiedenen Photolyasen wurde ebenfalls untersucht. Die Photoreduktion von PhrB wurde durch Mg2+ negativ beeinflusst, während bei PhrA Mg2+ einen stimulierenden Effekt hatte. Es stellte sich klar heraus, dass die Abhängigkeit von Mg2+ bei der DNA-Reparatur der (6-4) BCP und nicht bei der Photoreduktion zu suchen ist. Die veranlasste uns zu der Annahme, dass Mg2+ die DNA-Bindung und -Reparatur in (6-4) BCP-Proteinen beeinflusst. Zusammen mit den Strukturdaten und der Sequenzanalyse fanden wir eine vorgeschlagene Mg2+ Bindungsposition neben der DNA-Läsion und modifizierten die beiden betreffenden Aminosäuren durch ortsgerichtete Mutagenese. Der Effekt von Mg2+ ging für beide Mutanten verloren, während die Basisreparaturaktivität ohne Mg2+ von der Mutation nicht beeinflusst wurde. Vermutlich fördert Mg2+ die Bindung der (6-4) Läsion und erhöht die Elektronen-Affinität des Substrats. Außerdem wird die Barriere für Elektronentransfer verringert, wodurch und die Reaktion reibungsloser verläuft. Ich untersuchte auch die Reparatureffizienz für verschiedene Längen einzelsträngiger und doppelsträngiger DNA. Je länger die DNA war, desto schneller war die Reparatur. Bei einer Länge der DNA von 12 nt oder mehr änderte sich allerdings mit Zunahme der Länge die Geschwindigkeit der Reparatur nicht mehr.
In dieser Arbeit werden auch die Mutanten PhrB-Y424F und PhrB-I51W vorgestellt. Tyr424 von PhrB ist Teil der DNA-Bindungsstelle und könnte eine Elektronenverbindung zum Fe-S-Cluster bilden. Die PhrB-Y424F-Mutante zeigte eine starke Verringerung der Bindung von Läsions-DNA und DNA-Reparatur. Die Mutante PhrB-I51W ist durch den Verlust des DMRL-Chromophors, reduzierte Photoreduktion und reduzierte DNA-Reparaturkapazität gekennzeichnet. Die Kristallstrukturen zeigen eine hohe Übereinstimmung mit der Wildtyp-Struktur, somit beeinflussen Mutationen nur lokale Proteinumgebungen.
Die Photoreduktion von PhrB sich unterscheidet von dem typischen Muster, da die dem FAD benachbarte Aminosäure der Elektronenkaskade ein Tyrosin (Tyr391) ist, während Photolyasen und Cryptochrome anderer Gruppen ein Tryptophan als direkten Elektronendonor von FAD besitzen. In einer Mutante, in der Tyr391 durch Tryptophan ersetzt wurde, ging der Cofaktor-FAD verloren und die PhrB-Struktur war instabil. Trp342 und Trp390 sind für den Ladungstransfer essentiell sind. Trp342 befindet sich an der Peripherie von PhrB. Die Rolle von Tyr391, die zwischen Trp390 und FAD liegt, war jedoch unklar, da der Ersatz durch Phenylalanin die Photoreduktion nicht blockierte. Bei der Substitution von Tyr391 durch Ala wurde die Photoreduktion blockiert, was darauf hindeutet, dass Tyr391 ein Teil der Elektronentransferkette ist und zeigt, dass der Ladungstransfer über die Triade 342-391-390 erfolgt. Diese Ergebnisse deuten auf ein tunneling (Elektronentransfer ohne Ladungsänderung) zwischen Trp390 und FAD hin.

The (6-4) photolyases of the bacterial cryptochrome/photolyase (BCP) group belong to a family of flavoproteins acting as repair enzymes for UV-B induced DNA lesions (photolyases) or as blue light photoreceptors (cryptochromes). The (6-4) BCP proteins are widely distributed in prokaryotes.
In this work 3 members of the (6-4) BCP group, PhrB of Agrobacterium fabrum, CryB of Rhodobacter sphaeroides and Proma-PL from Prochlorococcus marinus, were compared with a eukaryotic (6-4) photolyase from Ostreococcus tauri OtCPF1, and a member of the class III CPD photolyases PhrA from Agrobacterium fabrum. ... mehrWe found that the DNA repair efficiency of (6-4) BCP proteins is largely stimulated by Mg2+ and other divalent cations, whereas no effect of divalent cations was observed in OtCPF1 and PhrA.
The effect of divalent cations on photoreduction among those different types of photolyases was also studied. It was found that photoreduction is negatively affected by Mg2+ in PhrB, but stimulated by Mg2+ in PhrA. It turned out clearly that Mg2+ affects DNA repair of (6-4) BCP proteins rather than photoreduction. So we speculated that the Mg2+ should effect DNA binding and - repair in (6-4) BCP proteins. Together with the structural data and sequence analysis, we found a proposed Mg2+ binding position next to the DNA lesion and further modified the two related amino acids by site directed mutagenesis. The stimulated effect of Mg2+ was lost for both mutants, although the base repair activity without Mg2+ remained unaffected by the mutation. During the repair process Mg2+ seems to increase 6-4 lesion binding and the electron affinity of the substrate so decreasing the electron transfer barrier and make the reaction smoothly. I also investigated the repair efficiency for different lengths of single stranded and double stranded DNA and found that the longer the DNA is, the faster the repair will be, but when the length of DNA reach to 12 nt, the increase of length will not help the repaired speed anymore.
In this work the two PhrB mutants, PhrB-Y424F and PhrB-I51W, were also investigated. Tyr424 of PhrB is part of the DNA-binding site and could provide an electron link to the Fe-S cluster. The PhrB-Y424F mutant showed greatly reduced the binding of lesion DNA and DNA repair. The mutant PhrB-I51W is characterized by the loss of the DMRL chromophore, reduced photoreduction and reduced DNA repair capacity.
We found that photoreduction of PhrB differs from the typical pattern because the amino acid of the electron cascade next to FAD is a tyrosine (Tyr391), whereas photolyases and cryptochromes of other groups have a tryptophan as direct electron donor of FAD. I found that replacing Tyr391 by tryptophan will cause losing of cofactor FAD and further make PhrB structure fold unstable. Besides, through mutagenesis studies we identified Trp342 and Trp390 essential for charge transfer. Trp342 is located at the periphery of PhrB. The role of Tyr391, which lies between Trp390 and FAD, is however unclear as its replacement by phenylalanine did not block photoreduction. When Tyr391 was replaced by Ala, the photoreduction was blocked, indicating Tyr391 is a part of the electron transfer chain and revealing that charge transfer occurs via the triad 342-391-390. These results favor an electron-tunneling mechanism of electron transfer.