Etablierung und Charakterisierung eines kontinuierlichen Herstellungsverfahrens von Liposomen aus Nanoemulsionen

Die vorliegende Arbeit behandelt ein spezielles Herstellungsverfahren zur Erzeugung funktionaler Lipidkapseln, sogenannten Liposomen, aus Nanoemulsionen und der Entwicklung der entsprechend benötigten Analytik. Eine Wasser-in-Öl (WO) Nanoemulsion, die den Wirkstoff in den wässrigen Tropfen enthält, wird als Zwischenprodukt genutzt. Die beladenen Tropfen werden mithilfe einer Zentrifugation in eine zweite wässrige kontinuierliche Phase transferiert, wodurch Liposomen erzeugt werden. Aus dem Ziel einer pharmazeutischen Verwendung ergeben sich komplexe Anforderungen an den Prozess. ... mehrDie Tropfengröße der Emulsion und der resultierenden Liposomen sollte bei etwa 200 nm liegen, mit einer obligatorischen Verwendung von Phospholipiden als Emulgator. Die Arbeit konzentriert sich auf drei Bereiche: erstens die Stabilisierung von WO Nanoemulsionen, zweitens die Nutzung von NMR zur Charakterisierung des Stoffsystems und drittens der Untersuchung des Transfers von Kolloiden zwischen zwei Flüssigphasen.

Über eine Analyse der Emulsionsstabilität konnte gezeigt werden, dass Phospholipide in WO Nanoemulsionen einer stetigen Instabilität unterliegen und es gelang den zugrundeliegenden Mechanismus zu identifizieren. Die Instabilität folgt einem bestimmten Muster, bei dem sich Tropfen zunächst durch Koaleszenz vereinigen bis die Grenzfläche ausreichend reduziert wird, um vom Emulgator belegt zu werden. Im Folgenden kommt es zu Ostwaldreifung, die insbesondere durch die Anwesenheit von Lipidmizellen vermittelt wird. Eine erhöhte Konzentration an Emulgator führt dabei nicht zu einer besseren Stabilität, da dieser aggregiert. Ausreichende Tropfengrößen und Stabilität sind daher nur unterhalb der kritischen Aggregationskonzentration zu erreichen. Mit einem angepassten Ultraschallverfahren konnten Tropfengrößen von 300 nm und eine ausreichende Stabilität für den Transfer erreicht werden.

Die Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) und –diffusometrie ermöglicht die selektive Analyse einzelner Molekülspezies und deren Diffusion in einer Emulsion oder in Liposomen. Aus der Diffusion lässt sich die Tropfengrößenverteilung ableiten. Es wurden zwei Verfahren zur Auswertung von komplexen Tropfengrößenverteilungen verglichen sowie deren Validität und Voraussetzungen bewertet. Für die Analyse von Nanoemulsionen konnte das bestehende Modell erweitert werden, sodass nun Tropfengrößen im Bereich unterhalb eines Mikrometers zugänglich sind. Weiterhin bietet die NMR die Perspektive die Einkapselung von Wirkstoff, das Verhalten des Emulgators und einen möglichen Austausch zwischen den Tropfen oder Phasen zu verfolgen.

Der Transfer kolloidaler Partikel durch eine flüssig-flüssig Phasengrenze, als Vereinfachung der instabileren Tropfen, wurde mit Modellpartikeln theoretisch und experimentell beschrieben. Die Bilanzierung der wirkenden Kräfte zeigt die benötigte Arbeit für den Transfer, die durch die Zentrifugation aufgebracht werden muss. Der Ansatz konnte experimentell validiert werden und spezifiziert die Abhängigkeit von der Partikelgröße, den Materialeigenschaften und den experimentellen Parametern wie der Zentrifugationsgeschwindigkeit. Der Transfer wird für kleine Partikel zunehmend anspruchsvoller, da im Bereich von mehreren hundert Nanometern die Grenzflächenkräfte dominieren. Nanopartikel neigen zur Agglomeration an der Grenzfläche und können nur mit einem Mindestaufwand wie gewünscht als Einzelkorn transferiert werden.

Insgesamt wurde das Herstellungsverfahren für Liposomen umfassender untersucht, als es der bisherige Stand der Technik war. Als Voraussetzung für das Verfahren wurden die Emulsionen optimiert, mit der NMR eine leistungsfähige Analytik etabliert und der Transfer mit den eingehenden Faktoren analysiert. Die aufgezeigten Limitierungen bilden die Basis für zukünftige Verbesserungen des Konzepts.

The presented thesis discusses a specific production process for the generation of functional lipid capsules, also known as liposomes, using nanoemulsions and the development of the required analytics. A water-in-oil (WO) nanoemulsion, which contains the active pharmaceutical ingredient (API) within the aqueous droplets, is used an intermediate. The loaded droplets are transferred into a second continuous and aqueous phase via centrifugation, thereby producing liposomes. The aim of a pharmaceutical application leads to complex requirements for the process. The droplet size of the emulsion and the resulting liposomes should be in the range of 200 nm, with an obligatory use of phospholipids as emulsifier. ... mehrThe thesis is focused on three aspects: first, the stability of WO nanoemulsions, second, the use of NMR for the characterisation of the formulation and third, the investigation on the transfer of colloids between two liquid phases.

By analysing the emulsion stability it was shown, that phospholipids in WO nanoemulsion are prone to a constant instability and it was possible to identify the underlying mechanism. The instability is following a certain pattern in which the droplets are growing due to coalescence, until the interface is reduced sufficiently to enable a full coverage by an emulsifier. In the following, Ostwald ripening is dominant, which is enabled by the presence of lipid micelles. An increased concentration of emulsifier does not lead to a better stability, because the insoluble excess forms aggregates. The required droplet sizes and stability is therefore only available at concentrations below the critical aggregation concentration. With an adapted ultrasound process, the droplet sizes were reduced to 300 nm and a satisfactory stability was accomplished.

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and diffusometry allow to selectively analyse single molecular species and their diffusion within an emulsion droplet or a liposome. The droplet size distribution can be derived from the diffusion behaviour. Two methods for the evaluation were tested and compared on complex droplet size distributions as well as assessing the validity and prerequisites of the approaches. The known model was extended for the analysis of nanoemulsions, making droplet sizes below one micrometre accessible. Further, NMR is offering possibilities to consider the encapsulation efficiency of API, the behaviour of the emulsifier and possible exchange of molecules between droplets or phases.

The transfer of colloidal particles, as a simplification of the more unstable droplets, was described experimentally and theoretically using model particles. The balance on acting forces shows the required work for the transfer, which has to be contributed by the centrifugation. The approach was validated experimentally and specifies the dependency on the particle size, the material properties and the experimental parameters, such as the centrifugation speed. The transfer needs increasingly stronger forces for small particles, due to the increasing domination of the surfaces forces at sizes of several hundred nanometres. Nanoparticles are prone to agglomerate at the interface and can only be transferred as single particles with a certain minimum centrifugal force.

Overall the production process for liposomes was comprehensively considered in all aspects, leading clearly beyond the state of the art. As a condition for the process the emulsions were optimised, NMR was established a powerful analysis and the transfer with all its elements was understood. The presented limitations are the basis for future improvements of the concept.