Entwicklung eines mikrofluidischen Bioreaktors für die Kultivierung von Pflanzenzellen

Die direkte Herstellung pflanzlicher Sekundärstoffe mithilfe von Pflanzenzellkulturen, die in klassischen Produktionsverfahren, wie z. B. im Batch-Fermenter, durchgeführt werden kann, ist für einige Produkte gut beschrieben. Das bekannteste Produkt ist sicherlich Paclitaxel [1]. Daneben gibt es in Pflanzen wertvolle Verbindungen, die durch die Zusammenarbeit unterschiedlich differenzierter Zelltypen biosynthetisiert werden. Die Differenzierung der Pflanzenzelltypen und somit die Produktion dieser Verbindungen werden jedoch unter den Bedingungen im Batch-Fermenter beeinträchtigt. ... mehrDa auch eine alternative Herstellung vieler dieser komplexen Verbindungen über die chemische Syntheseroute bis heute nicht möglich ist, müssen diese pflanzlichen Sekundärstoffe direkt aus den Pflanzen extrahiert werden.

Die im Rahmen dieser Dissertationsarbeit neu entwickelten, modularen mikrofluidischen Bioreaktoren ermöglichen die technische Nachbildung von Pflanzengeweben, indem zwischen verschiedenen Zelltypen mit unterschiedlichen metabolischen Leistungen ein Fluss hergestellt wird. Das synthetisierte Produkt kann im Durchfluss aufgefangen und extrahiert werden. Durch den modularen Aufbau lassen sich flexible Kombinationen erzeugen. Überdies sind zwei Ansätze realisierbar: die Parallelisierung zum optimierten Vorscreening geeigneter Pflanzenzelltypen mit geringer Zellzahl in einem 100 µl-Bioreaktor und die Modularisierung zur fluidischen Koppelung ausgewählter Pflanzenzelltypen mit höherer Zellzahl in einem 800 µl-Bioreaktor.

Zur Herstellung dieser mikrofluidischen Bioreaktoren aus biokompatiblen und transparenten Bauteilen erfolgte das Heißprägen aus Polycarbonat (PC) und Polyethylenterephthalat (PET). Das anschließende Ultraschallschweißen dieser Bauteile und die gleichzeitige Integration einer Membran sowie anwenderfreundlichen Schlauchanschlüssen stellt eine geeignete und für die Massenfertigung kompatible Fügetechnologie dar. Dazu wurde ein zweistufiger Ultraschallschweißprozess entwickelt, bei welchem im ersten Schritt eine PET-Membran mit einem PET-Gewebe direkt auf eine Bauteilhälfte ultraschallgeschweißt werden konnte. Im zweiten Schritt wurden die fluidischen Kontaktierungen durch Schlauchanschlüsse in der Bauteilebene realisiert und die zweite Bauteilhälfte gefügt. Dadurch sind die mikrofluidischen Bioreaktoren 3,6-4,2 mm hoch und die Pflanzenzellen können während der Kultivierung direkt unter einem Mikroskop beobachtet werden.

Der Betrieb der mikrofluidischen Bioreaktoren wurde unter sterilen Bedingungen mit den Pflanzenzelllinien Nicotiana tabacum, Catharanthus roseus und Taxus chinensis durchgeführt und belegte in ersten Ansätzen das modulare Prinzip. Dabei war die Überwachung wichtiger Parameter bezüglich Physiologie, Morphologie, Viabilität und Teilungsaktivität der Zellen möglich und konnte außerdem durch einen pH-Sensor erweitert werden.

Durch einen Messeinsatz für die NMR-Spektroskopie und eine numerische Strömungssimulation wurde verifiziert, dass die Pflanzenzellen sicher mit Nährstoffen versorgt werden. Abschließend wurde eine Kostenanalyse für eine Umsetzung für größere Stückzahlen durchgeführt.

Secondary plant metabolites can be synthesized directly with plant cell cultures. For many products, the standard production processes, e. g. batch-fermentation, are well described. The best known product is certainly Paclitaxel [1]. In addition, there are valuable components in plants that are biosynthesized through the collaboration of various differentiated cell types. However, many of these complex components cannot be produced by chemical synthesis. But since the differentiation of plant cell types and thus the production of these components is suppressed under conditions in batch-fermenters, these secondary plant metabolites must be extracted directly from plants.
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The new modular microfluidic bioreactors developed within this work enable the technical imitation of plant tissue and generate a common flow between various cell types with different metabolic performances. The synthesized product can be collected in the flow and then be extracted. The modular setup allows flexible combinations to be realized. In addition, two approaches are possible: parallelization for optimized pre-screening of suitable plant cell lines with small cell numbers in 100 µl bioreactors and modularization for fluidic connection of selected plant cell types in higher cell numbers in 800 µl bioreactors.

The microfluidic bioreactors are fabricated from biocompatible and transparent housings by hot embossing of polycarbonate (PC) and polyethylene terephthalate (PET). This is followed by ultrasonic welding and the simultaneous integration of membrane and user-friendly hose fittings, which represent a joining technology that is feasible for mass production. For this purpose, a two-step ultrasonic process was developed. First, the PET membrane was welded directly with a PET mesh on one housing. Second, the fluidic connection has been realized in-plane and the second housing joined. As a result, the microfluidic bioreactors were 3,6-4,2 mm high and the plant cells can be observed directly under a microscope during their cultivation.

The operation of the microfluidic bioreactors was carried out under sterile conditions with the plant cell lines Nicotiana tabacum, Catharanthus roseus and Taxus chinensis. Thereby, the modular principle was proved in first approaches. Controlling important parameters such as cell physiology, morphology, viability and division activity was possible, and the range was extended by a pH sensor.

A supply of nutrient solution to the plant cells was verified by a special inlet for NMR spectroscopy and a numerical flow simulation. Finally, a cost analysis was carried out to implement a pro-duction process with higher quantities of microfluidic bioreactors.