Interaction between two bacteriophytochromes and their signal transduction in Agrobacterium fabrum

Agrobacterium fabrum ist ein nicht photosynthetisch aktives, gramnegatives, stäbchenförmiges Bodenbakterium welches die Bildung von Wurzelhalsgallentumoren in mindestens 140 Arten von Dikotyledonen und Gymnospermen auslösen kann. Die Tumorbildung wird durch den Transfer der T-DNA, einem Bereich auf dem Ti-plasmid, in das Pflanzengenom initiiert. Für diesen Transfer von DNA wird das sogenannte Typ-IV-Sekretionssystem verwendet.
Frühere Ergebnisse unserer Gruppe zeigten, dass weißes Licht die Infektion des Stamms der Gurkenpflanzen (Cucumis sativus) mit A. fabrum unterdrückt. ... mehrLichtwahrnehmung wird über Photorezeptor-Proteine wie z.B. Phytochrome ermöglicht. Von diesen Rotlichtrezeptoren gibt es zwei in Agrobacterium fabrum, genannt Agp1 und Agp2. Auch die Konjugation, ein ähnlicher Prozess bei dem einzelsträngige Plasmid-DNA an benachbarte Bakterien weitergegeben wird, sowie auch die Bewegung von A. fabrum zeigen eine Phytochrom-abhängige Regulation. Neben dem Typ-IV-Sekretionssystem besitzt A. fabrum auch noch das Typ-VI-Sekretionssystem, welches für die interbakterielle Kompetition nötig ist. Das T6SS dient hierbei der Übertragung von toxischen Proteinen an benachbarte Bakterien.
In dieser Arbeit wurden Wildtyp- und Phytochrom-Mutanten Stämme von A. fabrum genutzt, um die Funktion der beiden Phytochrome näher zu bestimmen. Es wurde herausgefunden, dass sowohl die Mutanten ohne Phytochrom, als auch die Mutanten mit nur einem Phytochrom schneller wachsen als der Wildtyp. Die gleichen Stämme wurden auch dafür verwendet, den Einfluss von Phytochrom auf die Infektion der Stämme und Blätter von Nicotiana Benthamiana in Dunkelheit und unter kontinuierlichem Rotlicht bei Raumtemperatur zu untersuchen. Die Phytochrom-Doppelmutante zeigte einen negativen Einfluss auf die Infektion. Zudem konnte ein Agp1 inhibierender, sowie ein Agp2 fördernder Effekt von Rotlicht gefunden werden.
Um herauszufinden, ob es eine Interaktion zwischen den Phytochromen Agp1 und Agp2 gibt, wurden verschiedene Experimente, darunter Größenausschlusschromatographie, Photokonversion, Dunkelreversion, Autophosphorylierung und Messungen bezüglich der Chromophorassemblierungskinetik, durchgeführt. In allen Ansätzen zeigten die von den Mixturen der beiden Phytochrome erhaltenen Daten Unterschiede gegenüber den unter der Annahme einer fehlenden gegenseitigen Beeinflussung der beiden Phytochrome erwarteten Einzelmessungen und deuten dadurch darauf hin, dass es eine direkte Interaktion in vitro gibt. Diese Interaktion legt ein in vivo Zusammenwirken der beiden Phytochrome nahe.
Die Quantifizierung der Expressionslevel des Proteoms in WT A. fabrum und der Phytochrom-Doppelmutante zeigt, dass bei Anwesenheit von Phytochrom die Expression des für die Konjugation notwendigen Proteins traA (Atu5111) begünstigt wird. Zusätzlich konnten Einflüsse auf das an der Chemotaxis beteiligte Protein mcpC (Atu0872), das Flagellenprotein motC (Atu0570) und des Pilusprotein (Atu0220) nachgewiesen werden. Zudem wurden Effekte auf das Hämolysin-coregulierte Protein (Atu4345) und das Toxin Atu4347 des T6SS beobachtet. Es wurden Kompetitionsexperimente mit Wildtyp A. fabrum bzw. mit der Phytochrome-Doppelmutante durchgeführt, indem sie mit Bodenbakterien inokuliert, die DNA extrahiert und anschließend die hypervariable Region V2 der 16S rRNA analysiert wurde, um die Zusammensetzung der Bakterienmixtur herauszufinden. Zusammengefasst legen die Ergebnisse der Proteomuntersuchung und der Kompetitionsexperimente nahe, dass das Vorhandensein von Phytochromen die interbakterielle Konkurrenzfähigkeit verbessert und dadurch die Überlebensrate von A. fabrum erhöht.

Agrobacterium fabrum is a non-photosynthetic, gram-negative, rod-shaped soil bacterium that causes the formation of tumours known as the crown gall disease in at least 140 species of dicotyledons and gymnosperms. The tumour formation is initiated by the transfer of the so-called T-DNA of the Ti plasmid from bacteria into the genome of plants. For this transfer of DNA the Type IV secretion system (T4SS) is utilized.
Previous results from our group showed that white light suppresses the infection of cucumber (Cucumis sativus) stems with A. fabrum. Light perception is accomplished by photoreceptor proteins like e.g. ... mehrthe red light photoreceptors called phytochrome. A. fabrum contains two phytochromes, termed Agp1 and Agp2. Conjugation, a similar process in which single stranded plasmid DNA is transferred to adjacent bacteria, was shown to be regulated by the presence of phytochrome. The movement is also controlled by phytochrome. Additionally, A. fabrum contains the type VI secretion system (T6SS) for competition against other bacteria. The T6SS can be used to transfer toxic proteins to adjacent bacteria.
In this work, A. fabrum wild type (WT) and phytochrome mutant strains were used to determine the function of both phytochromes. It was found that both single and double phytochrome mutants grow faster than the WT. The same strains were also used to check for an effect on the infection of the stem and the leaves of Nicotiana benthamiana in darkness and under continuous red light irradiation at room temperature. The double phytochrome mutants showed a negative effect on the infection. Moreover, red light could inhibit the effect of Agp1 and promote the influence of Agp2.
In order to study whether there is an interaction between the phytochromes Agp1 and Agp2, multiple experiments, including size exclusion chromatography, photoconversion, dark reversion, autophosphorylation and measurements of the chromophore assembly kinetics, were performed. In all assays, the data obtained from mixtures of the two phytochromes show differences to the data that were predicted based on the assumption that one phytochrome does not affect the respective other, indicating that there is a direct interaction in vitro. This interaction partially explain a coaction of both phytochromes in vivo.
Quantification of the expression levels of the proteome in WT A. fabrum and the double mutant strain showed that phytochromes could promote the expression of the protein traA (Atu5111) necessary for conjugation. Additionally, there were influences on the chemotaxis protein mcpC (Atu0872), the flagellar protein motC (Atu0570) and the pilus protein (Atu0220). Moreover, an effect on the haemolysin coregulated protein (Atu4345) and the protein toxin Atu4347 of the T6SS was observed. Competition assays with either A. fabrum WT or double phytochromes mutant inoculated together with soil bacteria followed by analysis of the hypervariable region V2 of the 16S rRNA gave insight into the composition of bacteria after letting them compete for a given time. Taken together, the results from proteomics and competition assays suggest that the presence of phytochromes could improve the interbacterial competitiveness and therefore the survival rate of A. fabrum.