Abstract:
Licht ist ein wichtiger Umweltfaktoren, der die Entwicklungsprozesse und metabolischen Prozesse von fast allen Organismen der Erde beeinflußt. Filamentöse Pilze können Licht mittels verschiedener Photorezeptoren wahrnehmen. Der schwarze Sporen-produzierende Pilz Alternaria alternata ist ein weit verbreitetes prä/post-Ernte Pflanzenpathogen, der in der Lage ist mehr als 70 Sekundärmetabolite zu produzieren. A. alternata kann auch selten als Humanpathogen Allergien verursachen. Viele Prozesse in A. alternata werden durch Licht gesteuert. Rotlicht stimuliert die Sporenproduktion, aber kontinuierliche Beleuchtung mit Blauchlicht inhibiert die Sporenproduktion komplett. ... mehrInteressanterweise kann der inhibierende Effekt von Blaulicht durch Rotlicht aufgehoben werden, was eine Verknüpfung zwischen den Lichtsensorsystemen suggeriert.
Das A. alternata Genom kodiert ein Phytochrom (FphA), ein WC-1 Ortholog (LreA), ein Opsin (NopA) und ein Cryptochrom (CryA) als putative Photorezeptoren. Neben dem White Collar-1 Ortholog LreA, das schon zum Teil untersucht wurde, waren weitere Funktionsanalysen der Gene durch Schwierigkeiten bei der Konstruktion von homologen knock-out Stämmen limitiert. Jedoch wurde die CRISPR/Cas9 Technologie in A. alternata etabliert, die schnelle und präzise Veränderung von Gensequenzen und somit Studien von Genfunktion und –regulation zulässt. Mit der Verwendung dieser Technologie, haben wir die Rolle von FphA und LreA sowie das Zusammenspiel mit dem high-osmolarity glycerol (HOG) mitogen-activated protein (MAP) Kinase Signalweg durch loss-of-function Mutationen für fphA, lreA, and hogA untersucht.
Die Deletion von fphA, lreA and hogA führte zu einer Reduktion der Sporulation im Dunkeln, was eine aktivierende Funktion der Photorezeptoren (FphA und LreA) und HogA suggeriert. Die Entwicklung von Konidiophoren benötigt eine transkriptionelle Kaskade, die aus brlA, abaA und wetA besteht. Nach 60 min Beleuchtung mit Weißlicht wurde die Expression von abaA und wetA in fphA und lreA Mutanten aufgehoben, wodurch die wichtige Rolle von Photorezeptoren in der Sporulation und asexuellen Entwicklung bestätigt wurde. Ein BrlA Ortholog wurde nicht gefunden.
Die Auskeimung von Konidien war in Rot-, Blau-, Grün- und Dunkelrotlicht verzögert. Die Deletion von Phytochrom, aber nicht von lreA, hob die Repression unter allen Bedingungen auf, was die hemmende Funktion von FphA und die Präsenz zusätzlicher Blaulicht Rezeptoren bestätigt.
Weitergehend wurde die Auswirkung von Licht und die Rolle von FphA, LreA und HogA auf die Sekundärmetabolitbildung untersucht. Die Alternariolproduktion war sowohl im Licht als auch im Dunkeln strikt von hogA abhängig. Stattdessen wurde die Bildung einer gelben Substanz stimuliert. Die Blau- und Grünlicht Stimulation der Alternariolproduktion war nur von LreA abhängig und nicht von FphA. Die Resistenz gegenüber oxidativem Stress durch Wasserstoffperoxid und Mennadion war in dem fphA und lreA-Deletionsstamm, aber nicht im hogA Deletionsstamm erhöht. Die erhöhte Resistenz war unabhängig von den Lichtbedingungen und kann durch eine Induktion von Katalasen und Superoxiddismutasen erklärt werden.
Zur weiteren molekularen Analyse wurde die Induktion von ccgA (clock-controlled gene in Neurospora crassa and light-induced in Aspergillus nidulans) untersucht. Das Gen wird auch in A. alternata durch Licht induziert. Die Induktion war strikt von LreA und nur leicht von FphA abhänig. Für die weitergehende Charakterisierung der Rollen von fphA, lreA, and hogA, wurde die Regulation weiterer putativer lichtregulierter Gene untersucht. Die Expression des Katalase Gens catA and des short-chain dehydrogenases/reductases Gens (AAT_PT02522) ist von FphA, LreA and HogA abhängig. Die Lichtinduktion von ferA (ein putatives Ferrochelatasegen) and bliC (bli-3, light regulated, unbekannte Funktion) benötigen LreA und HogA, aber nicht FphA.
Da vorherige Untersuchungen in A. nidulans, N. crassa and Trichoderma viridae eine Interaktion zwischen den Rot und Blaulicht Photorezeptoren mit der HOG-MAP-Kinase Kaskade suggerieren, wurde die Expression von Genen, die durch osmotischen Stress induziert werden, in den drei Mutanten untersucht. Die Transkriptmenge von hogA, atfA und ccgA war in fphA, lreA und hogA Mutanten reduziert. Während die Expression von bliC von lreA und hogA abhängig war, wies der fphA Deletionsstamm eine vergleichbare Expression zum Wildtyp auf. Desweiteren wurde die Phosphorylierung von HogA unter verschiedenen Lichtbedingungen durch Immunostaining untersucht. Nach Beleuchtung mit Rot und Blaulicht wurde Fluoreszenz im Zytoplasma und angereichert im Zellkern detektiert. Die Stimulation des Signals wurde nicht im fphA oder LreA Mutantenstamm beobachtet, wodurch die Aktivierung des Hog Signalweges durch FphA und LreA suggeriert wird.
Der Verlust von fphA verstärkte die Pathogenität auf Tomaten, während lreA und hogA Deletionsstämme eine abgeschwächte Virulenz im Vergleich zum Wildtyp aufweisen. Zudem fanden wir, dass fphA eine Rolle in der Temperaturwahrnehmung spielt.
Abstract (englisch):
Light is one of the most crucial environmental factors that impacts on development and metabolic processes of almost all organisms on earth. Filamentous fungi can perceive light using different photoreceptors and transduce the signal into biochemical outputs that modulate cellular and molecular responses within the ambient light environment. The black spore producing fungus Alternaria alternata is a common pre/post-harvest plant pathogen capable of producing more than 70 secondary metabolites. A. alternata is rarely implicated as human pathogen (allergy). Many processes in A. ... mehralternata are triggered by light. Whereas red light stimulates sporulation, continuous illumination with blue light completely inhibits sporulation. Interestingly, the inhibitory effect of blue light can be reversed by red light, suggesting cross-talk between the two light-sensing systems.
The A. alternata genome encodes a phytochrome (FphA), a white collar 1 (WC-1) orthologue (LreA), an opsin (NopA), and a cryptochrome (CryA) as putative photoreceptors. Apart from the white collar 1 orthologue LreA, which has been studied to some extent, further gene-function analyses have been limited due to difficulties to generate homogenous knock-out strains. However, recently, the CRISPR-Cas9 technology was established in A. alternata facilitating rapid and precise editing of genetic sequences and studies of gene function and regulation. Using this technology, we investigated the role of FphA and LreA and the interplay with the high-osmolarity glycerol (HOG) mitogen-activated protein (MAP) kinase pathway by creating loss-of-function mutations for fphA, lreA, and hogA.
Deletion of fphA, lreA and hogA resulted in a reduction of sporulation in the dark, suggesting an activating function of the photoreceptors (FphA and LreA) and HogA. Conidiophore development in A. nidulans requires a transcriptional cascade consisting of brlA, abaA and wetA. We investigated the effect of the deletion of FphA and LreA on wetA and abaA genes which are part of the central regulatory cascade of conidiation in Aspergillus. A brlA orthologue was not found in the A. alternata genome. After 60 min of white light illumination, the expression of wetA and abaA was abolished in the fphA- and lreA- mutant strains confirming the importance of the photoreceptors in the activation of sporulation and asexual development. Germination of conidia was delayed in red, blue, green, and far-red light. Deletion of phytochrome, but not lreA, released the repression under all conditions, suggesting repressing functions of FphA and the presence of additional blue-light photoreceptors, respectively.
Next, we analysed the impact of light on secondary metabolite formation in the absence of FphA, LreA and HogA. The stimulation of alternariol formation was lost in the hogA- mutant strain irrespective of light and dark conditions with the upregulation of a yellow compound. Blue- and green-light stimulation of alternariol formation depended on LreA and not FphA. Oxidative stress response to hydrogen peroxide and menadione were enhanced in the fphA- and lreA- but not hogA- deletion strains independent of light due to the upregulation of catalases and superoxide dismutases.
We found that light induction of ccgA (clock-controlled gene in Neurospora crassa and light-induced in Aspergillus nidulans) appears to be strictly dependent on LreA and only to some extent on FphA. In order to further characterize the roles of fphA, lreA, and hogA, we studied their role in regulating other putative light-regulated genes. The expression of the catalase gene catA and short-chain dehydrogenases/reductases gene (AAT_PT02522) depended on FphA, LreA, and HogA. Light induction of ferA (a putative ferrochelatase gene) and bliC (bli-3, light regulated, unknown function) required LreA and HogA but not FphA.
Since previous reports in A. nidulans, N. crassa and Trichoderma viride suggested an interaction between the red and blue light photoreceptors with the HOG MAP kinase cascade, we investigated the expression of osmotic-stress induced genes in the three mutant strains. The transcript levels of hogA, atfA, and ccgA were reduced in the fphA, lreA- and hogA- mutant strains. While the expression of bliC was dependent on LreA and HogA, the fphA- deletion strain exhibited similar expression levels compared to the WT. We further analysed the phosphorylation of HogA by immunostaining under different light conditions. After illumination with red or blue light, fluorescence was detected in the cytoplasm and enriched in nuclei. The stimulation of the signal was not observed in the ΔfphA or ΔlreA mutant strains suggesting light activation of the HogA pathway depended on FphA and LreA.
The loss of fphA enhanced pathogenicity on tomato, whereas the lreA- and hogA- mutant strains showed reduced virulence as compared to the WT. We also found that phytochrome plays a role in temperature sensing.
