Development of a universal alignment medium for the extraction of RDCs and structure elucidation with tensorial constraints

In der hochauflösenden Kernresonanzspektroskopie liefern rest-anisotrope Parameter wie dipolare Restkopplungen (RDcs), restliche chemische Verschiebungsanisotropien (RCSAs) und quadrupolare Restkopplungen (RQCs) wertvolle Informationen, die zu den unter isotropen (standard-) Bedingungen gemessenen NMR-Parametern für die Strukturverfeinerung und -aufklärung komplementär sind. Daher ist ein homogenes und ausreichend schwaches sogenanntes "Alignment" in sogenannten Alignmentmedien erforderlich, um eine geringe Anisotropie in der Probe zu induzieren. Obwohl eine Vielzahl unterschiedlicher Alignmentmedien und -methoden existiert, werden sie recht selten genutzt, da die derzeit verfügbaren üblichen Alignmentmedien entweder speziell für die Anwendung mit kleinen organischen Molekülen oder für große (Bio-) Makromoleküle entwickelt wurden und ihre Verwendung auf bestimmte Lösungsmittel beschränkt ist. ... mehr

Neben flüssigkristallinen Phasen werden mechanisch gestreckte oder gestauchte Polymergele zur adäquaten Ausrichtung von gelösten Stoffen eingesetzt. Oft kann die Präparation von Proben bis zum Äquilibrieren bis zu Wochen und Monaten dauern, was die Nutzung dieser Methoden im kommerziellen Bereich eher erschwert. Frühere Untersuchungen mit vernetzten Polyethylenoxid-Hydrogelen (PEO) zeigten eine erhebliche Quellung in einer Vielzahl von Lösungsmitteln. Leider erforderte die Vernetzung die Verwendung von $\beta$- oder $\gamma$-Strahlung oder wochenlange Bestrahlung mit ultraviolettem Licht. In dieser Arbeit wird ein schneller Syntheseweg optimiert und vorgestellt, um homogene Gelstäbchen auf Basis von PEO als Alignmentmedien herzustellen, der mit den in jedem modernen Labor verfügbaren Mitteln nachvollzogen werden kann. Darüberhinaus wird das Quellverhalten in einer Vielzahl von reinen Lösungsmitteln und Gemischen aufgezeigt und der Einfluss des Massengehalts während der Vernetzung untersucht.

Durch Verwendung eines Ausgangsmaterials mit geringer Dispersität wird Kontrolle über die Verteilung der Kettenlängen zwischen den Vernetzungspunkten ermöglicht, wodurch homogene Gele mit schmalen Linienbreiten erhalten werden. Gequollene Poly(ethylen oxid) diacrylat (PEODA) Gele, die mit unterschiedlichem Massenanteil vernetzt wurden, werden zusätzlich mit Doppelquanten NMR (DQ-NMR) untersucht, um das Verhältnis von vernetztem Anteil und der Solfraktion inklusive der Defekte im Netzwerk zu ermitteln. Die Anwendbarkeit von PEODA in skalierbaren Streck- und Kompressionsapparaturen wird präsentiert und erfolgreich mit reinen Lösungsmitteln und Gemischen demonstriert. Hierbei wird eine Methode eingeführt, die ein schnelles externes Äquilibrieren und Übertragen in die Probenröhrchen ermöglicht. Es wird gezeigt, dass durch Feinabstimmung verschiedener Parameter, vernetztes PEODA als universelles Alignmentmedium für gelöste Substanzen, die von kleinen Naturstoffen bis zu Proteinen reichen, geeignet ist.

Die bisher angewandte Methode der manuellen Extraktion von Kopplungen ist zeitaufwändig und subjektiv. Es wird ein Verfahren zur halbautomatischen Extraktion von Kopplungen vorgestellt, welches mathematisch auf der Anwendung von Kreuz- bzw. Autokorrelationen beruht. Für die Auswertung von RDCs an kleinen organischen Molekülen, wurden Moleküldynamiksimulationen mit orientierenden Randbedingungen evaluiert und angewandt (engl.: molecular dynamics with orientational constraints, MDOC), einer Molekülmechanik-Methode, die ohne Annahmen über die Ausgangskonformation auskommt. Die Methode ermöglicht die Bestimmung des Konformationsraums anhand experimenteller anisotroper Daten, die als tensoriell orientierende Bedingungen in das Kraftfeld einfließen. Wenn gelöste Moleküle flexibel sind und in unterschiedlichen Konformationen auftreten, ist die Interpretation der Daten mit bisherigen Methoden aufgrund der gemittelten Natur der extrahierten Daten schwierig und Annahmen über auftretende Konformere müssen getroffen werden, die unter Umständen nicht gerechtfertigt sind. In diesen Fällen ist der MDOC Ansatz vorzuziehen, da die Interpretation der RDCs nicht durch die Wahl der Modellierung beeinflusst wird.

In high resolution NMR spectroscopy, residual anisotropic parameters like RDCs, RCSAs, and RQCs provide valuable information complementary to parameters derived in isotropic (standard) conditions for the structure elucidation and refinement. For their measurement, homogeneous and appropriate weak partial alignment in so-called alignment media are needed to induce the suitable anisotropy. Although a multitude of different alignment media does exist, they are applied rather seldom, because common alignment media presently available are either specifically developed for application with small organic molecules or for big macromolecules and their use is restricted to a narrow range of certain solvents.
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Besides liquid crystalline phases, mechanically strained polymer gels are used for the adequate alignment of solutes. The preparation of samples can take up to weeks and even months, which renders these methods rather unfavorable for commercial use. Earlier investigations with poly(ethylene oxide) (PEO) hydrogels showed considerable swelling in a wide variety of solvents. Unfortunately, cross-linking procedures required the use of $\beta$- or $\gamma$-radiation, or radiation with UV light for weeks. This work presents a quick, optimized synthesis route to yield homogeneous alignment media sticks based on diacrylated PEO (PEODA) that can be followed using standard equipment available in every modern laboratory. The swelling compatibility in a large variety of pure solvents and mixtures is compared and evaluated and the influence of the mass content during the cross-linking is demonstrated.

By using a starting material with small dispersity, control over the distribution of inter cross-link chain lengths is introduced, yielding quite homogeneous gels with narrow line-widths. Different mass containing swollen PEODA gels are therefore investigated with double quantum NMR (DQ-NMR) to reveal the amount of cross-linked network fractions and the sol fraction. PEODA allows inducing scalable anisotropy both in compressing as well as in stretching devices and is successfully applied with pure solvents and mixtures in this work. Here, a method is introduced, allowing fast equilibration and transfer into the sample tubes. In accordance with parameter fine-tuning, cross-linked PEODA is shown to be suitable for the alignment of solutes reaching from small natural products up to proteins, making it a universal alignment medium.

The existing manual method for extraction of couplings is time-consuming and subjective. A method for the semi-automated extraction of couplings is introduced, utilizing a procedure based on autocorrelation. For the data evaluation of RDCs on small organic molecules, Molecular dynamics with orientational constraints (MDOC), is applied. It enables the elucidation of the conformational space based on experimentally derived anisotropic data that is incorporated as tensorial orienting constraints into the force field. When solute molecules show flexibility and occur in different conformations, data interpretation with so far existing approaches can be difficult because of the averaged nature of extracted data. In these cases the MDOC approach is preferred as the RDC evaluation is not hampered based on the modeling of choice.