Abstract:
Glykolipide sind vielversprechende nichtionische Tenside mit einem breiten Anwendungsspektrum. Man begegnet ihnen täglich in Reinigungsmitteln, Pharmazeutika oder auch in Lebensmitteln. Aufgrund ihrer Vielseitigkeit und Präsenz in Hygieneprodukten steigt die Nachfrage weltweit kontinuierlich an. Die etablierte chemische Synthese von Glykolipiden weist einige Nachteile wie mangelnde Spezifität und Selektivität auf. Im Gegensatz zu den traditionellen Tensiden fossilen Ursprungs weisen sie nicht nur hervorragende Tensid- und Emulgiereigenschaften auf, sondern sind auch biologisch abbaubar und nicht toxisch für die Umwelt. ... mehrGlykolipide können durch mikrobielle Fermentation, durch chemische oder enzymatische Synthese unter Verwendung erneuerbarer Ressourcen hergestellt werden. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir unter Verwendung von Lipasen, dass die Esterbildung unter milden und nahezu wasserfreien Bedingungen erreicht werden kann, wobei letztere erforderlich sind, um die Kondensation anstelle der Hydrolysereaktion zu begünstigen. So wurde unter Verwendung von Lösungsmitteln mit geringer Wasseraktivität der enzymatisch synthetisierte Zuckeralkoholester, Sorbitollaurat, als Modellprodukt verwendet. Folglich hebt diese Dissertation die enzymatische Synthese als Methode der Wahl für die maßgeschneiderte Herstellung einer potenziell breiten Palette von neuartigen Tensiden hervor. Die Biokatalyse ermöglichte eine innovative Herangehensweise an dieses aktuelle Thema mit einem multidisziplinären Ansatz im Hinblick auf die aktuellen Bedenken zur Nachhaltigkeit.
Die Löslichkeit von Polyolen wie Zuckern oder Zuckeralkoholen in organischen Lösungsmitteln ist eher gering. Die enzymatische Synthese dieser Verbindungen ist jedoch in nahezu wasserfreien Medien unter Verwendung kostengünstiger und nachwachsender Rohstoffe möglich. Mit Hilfe von Lipasen kann die Esterbildung unter milden Bedingungen erreicht werden. Wir schlagen zunächst ein "2-in-1"-System vor, das die Löslichkeitsprobleme überwindet, da ein Deep Eutectic System (DES) aus Sorbitol und Cholinchlorid entweder ein rein organisches oder wässriges Medium ersetzt. Erstmals wurden 16 kommerziell erhältliche Lipase-Formulierungen verglichen und Faktoren, die den Umsatz beeinflussen, untersucht, um diesen Prozess dank einer neu entwickelten HPLC-ELSD-Methode zur Quantifizierung zu optimieren. So konnte bei der optimierten Synthese von Sorbitollaurat (SL) unter Verwendung von 50 g/L der Lipaseformulierung Novozym 435® bei 50°C eine 28%ige molare Umsetzung von 0,5 M Vinyllaurat zu seinem Zuckeralkoholmonoester erreicht werden, wenn das DES 5 Gew.-% Wasser enthielt. Nach 48h wurde das de novo synthetisierte Glykolipid durch Flüssig-Flüssig-Extraktion vom Medium abgetrennt, durch Flash-Chromatographie gereinigt und durch ein- und zweidimensionale Kernspinresonanz (NMR)-Experimente und Massenspektrometrie (MS) charakterisiert. Abschließend erbringen wir einen ersten Nachweis der Skalierbarkeit für diesen Prozess. Die Verwendung eines 2,5-L-Rührkesselreaktors (STR) ermöglichte eine Batch-Produktion bis zu 25 g/L in einem hochviskosen Zweiphasensystem.
Dennoch bleiben viele Herausforderungen bestehen und begrenzen die Erwartungen an eine industrielle Anwendung. Eine lange Produktionszeit und relativ niedrige Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten gehören zu den Barrieren, die es zu überwinden gilt. Wir konzentrierten uns in diesem Zusammenhang auf die Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeiten und Ausbeuten bei der Herstellung von Sorbitollaurat durch eine mikrowellenunterstützte Methode, die wir jedoch mit einer konventionellen Heizmethode verglichen. Es wurden auch verschiedene Lösungsmittelsysteme miteinander konkurriert, wobei sich 2M2B als ein leistungsfähigeres Lösungsmittelsystem als das DES erwies. So erlaubte die Verwendung von 20 g/L immobilisierter Lipaseformulierung, 0,75 M Vinyllaurat, 0,25 M Sorbitol bei 50°C in 2M2B eine 92%ige Konversionsausbeute zu erreichen, was einer 168 g/L Titerproduktion entspricht. Der Einsatz der Mikrowellentechnologie ermöglichte danach eine 50-fache Steigerung der ursprünglichen Reaktionsgeschwindigkeit im organischen Lösungsmittel bei 75°C. Die Wiederverwendung des Biokatalysators wurde auch in 2M2B und DES untersucht, wobei bei letzterem eine größere Destabilisierung des Enzyms festgestellt wurde. Wir bringen somit eine Nuance in die intensive Entwicklung, die DESs derzeit in der Literatur als Medium für die Biokatalyse erfahren. Nichtsdestotrotz zeigen wir ermutigende Aussichten auf Verbesserungen, um DESs konkurrenzfähig zu Standardmedien für Biokonversionen zu machen. Abschließend untersuchten wir die Effizienz unseres Downstream-Prozesses, der die vollständige Rückgewinnung von Sorbitollaurat nach 4 Zyklen der Flüssig-Flüssig-Extraktion ermöglicht.
Bestehende Berichte, die integrierte Prozesse zur Glykolipidproduktion aus nachwachsenden Rohstoffen beschreiben, verwenden viele Reaktionsschritte. Daher zielten wir darauf ab, das Verfahren zu vereinfachen. Durch die Verwendung von dielektrischer Mikrowellenerwärmung wurde die Herstellung von DESs zunächst erheblich beschleunigt. Unsere Vergleichsstudie ergab eine durchschnittlich 16-fach schnellere Vorbereitungszeit als die konventionelle Erhitzungsmethode in einem Inkubator. Darüber hinaus konnten Lipide aus robuster ölhaltiger Hefe-Biomasse erfolgreich bis zu 70% extrahiert werden, ohne die Vorbehandlungsmethode für den Zellaufschluss zu verwenden, wodurch der für einen solchen Prozess notwendigen Energieaufwand begrenzt. Angesäuerte DESs, die entweder aus Xylit oder Sorbit und Cholinchlorid bestanden, vermittelten den Eintopfprozess und ermöglichten die anschließende Umwandlung der Lipide in monoacylierte Palmitat-, Oleat-, Linoleat- und Stearat-Zuckeralkoholester. Somit zeigen wir, dass die Zugabe von immobilisierter Candida antarctica Lipase B (Novozym 435®) in einer angesäuerten DES-Mischung eine vereinfachte und schnelle Glykolipidsynthese unter Verwendung direkt ölhaltiger Hefebiomasse ermöglicht.
Schließlich stellen wir fest, dass der DES-ähnliche Manuka-Honig auch als Medium für die Glykolipidsynthese dienen kann. Diese übersättigte Zuckerlösung kann in Bezug auf die physikochemischen Eigenschaften mit den zuckerbasierten DESs verglichen werden. Da Honigprodukte für therapeutische Zwecke kommerziell verfügbar sind, erscheint es interessant, ihre Bioaktivität zu erhöhen. Im letzten Kapitel dieser Dissertation wird untersucht, ob die Anreicherung von medizinischem Honig mit in situ enzymatisch synthetisierten Glykolipiden die antimikrobielle Eigenschaft der Mischung verbessern kann. Die getesteten Mischungen bestehen aus Manuka-Honig, der mit Octanoat-, Decanoat-, Laurat- und Myristat-Zuckerestern angereichert ist, die jeweils als GOH, GDH, GLH und GMH bezeichnet werden. Um die Bioaktivität dieser Mischungen zu charakterisieren, wurde zunächst ein qualitatives Screening mittels Agar-Well-Diffusionstest mit Methicillin-resistentem Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Candida bombicola, Escherichia coli und Pseudomonas putida durchgeführt, das eine deutlich erhöhte Empfindlichkeit dieser Mikroorganismen gegenüber den verschiedenen mit Glykolipiden angereicherten Honigmischungen bestätigte. Dann wurde ein entworfener Biosensor E. coli-Stamm verwendet, der ein Stressreportersystem aufweist, das aus drei stressspezifisch induzierbaren, rot, grün und blau fluoreszierenden Proteinen besteht, die jeweils physiologischen Stress, Genotoxizität und Zytotoxizität übersetzen. Letzteres ermöglichte die Charakterisierung der Bioaktivität und zeigte eine sechsfache Steigerung des physiologischen Stresses durch GOH im Vergleich zu regulärem Manuka-Honig bei einer Konzentration von 1,6% (v/v). Der antibakterielle Agar-Well-Diffusionstest mit E. coli wurde dann durchgeführt und zeigte ein verbessertes hemmendes Potential mit GOH bei 20% (v/v) Konzentration.
Abstract (englisch):
Glycolipids are promising nonionic surfactants with a wide range of application. They can be encountered daily in cleaning agents, pharmaceuticals or even in food. Due to their versatility and presence in hygiene products, the demand is continuously increasing worldwide. The established chemical synthesis of glycolipids presents several disadvantages such as lack of specificity and selectivity. In contrast to the traditional surfactants from fossil origin, they are not only exhibiting excellent surfactant and emulsifying properties but are also biodegradable and non-toxic to the environment. ... mehrGlycolipids can be produced by microbial fermentation, by chemical or enzymatical synthesis using renewable resources. In the present work, using lipases, we outline that ester formation can be achieved under mild and nearly water free conditions, the latter being needed to favor condensation instead of the hydrolysis reaction. Thus, using solvents of low water activity, enzymatically synthesized sugar alcohol ester, sorbitol laurate, was used as a model product. Consequently, this dissertation highlights enzymatic synthesis as a method of choice for the tailor-made production of a potential wide range of novel surfactants. Biocatalysis enabled an innovative approach, in respect to current concerns on sustainability, of this topical subject with a multidisciplinary approach.
The solubility of polyols such as sugars or sugar alcohols in organic solvents is rather low. The enzymatic synthesis of these compounds is however possible in nearly water free media using inexpensive and renewable building blocks. We propose initially a “2-in-1” system that overcomes solubility problems, as a Deep Eutectic System (DES) made of sorbitol and choline chloride replaces an either purely organic or aqueous medium. For the first time, 16 commercially available lipase formulations were compared and factors affecting the conversion were investigated to optimize this process owing to a newly developed HPLC-ELSD method for quantification. Thus, using 50 g/L of lipase formulation Novozym 435® at 50°C, the optimized synthesis of sorbitol laurate (SL) allowed to achieve 28% molar conversion of 0.5 M of vinyl laurate to its sugar alcohol monoester when the DES contained 5 wt.% water. After 48h, the de novo synthesized glycolipid was separated from the media by liquid-liquid extraction, purified by flash-chromatography and characterized by one- and two-dimensional Nuclear Magnetic Resonance (NMR) experiments and Mass Spectrometry (MS). In completion, we provide an initial proof of scalability for this process. Using a 2.5 L stirred tank reactor (STR) allowed a batch production reaching 25 g/L in a highly viscous two-phase system.
Many challenges remain still, and limit expectations of industrial application. Extensive time of production and relatively low initial reaction velocities are among the barriers that need to be raised. We focused, in this context, on the intensification of the reaction velocities and yields, for the production of sorbitol laurate owing to a microwave-assisted method that we, nonetheless, compared to a conventional heating one. Different solvent systems were also put in competition, in which 2M2B revealed itself as a more performant solvent system than the DES. Thus, using 20 g/L of immobilized lipase formulation, 0.75 M of vinyl laurate, 0.25 M of sorbitol at 50°C in 2M2B allowed to reach 92% of conversion yield which corresponds to a 168 g/L titer production. Use of microwave technology allowed thereafter a 50-fold increase of the initial reaction rate in the organic solvent at 75°C. Re-use of the biocatalyst was studied as well in 2M2B and DES, highlighting in the latter a greater destabilization of the enzyme. We bring thus, nuance to the intense build-up DESs are currently undergoing, in literature, as media for biocatalysis. Nevertheless, we indicate encouraging prospects of betterment to make DESs competitive to standard media for bioconversions. In completion, we investigated the efficiency of our downstream processing that allows complete recovery of sorbitol laurate after 4 cycles of liquid-liquid extraction.
Existing reports describing integrated processes for glycolipid production from renewables use many reaction steps, therefore we aimed at simplifying the procedure. By using microwave dielectric heating, DESs preparation was first accelerated considerably. Our comparative study revealed a preparation time on average 16-fold faster than the conventional heating method in an incubator. Furthermore, lipids from robust oleaginous yeast biomass were successfully extracted up to 70% without using the pretreatment method for cell disruption, limiting logically the energy input necessary for such process. Acidified DESs consisting of either xylitol or sorbitol and choline chloride mediated the one-pot process, allowing subsequent conversion of the lipids into mono-acylated palmitate, oleate, linoleate, and stearate sugar alcohol esters. Thus, we show strong evidence that addition of immobilized Candida antarctica Lipase B (Novozym 435®), in acidified DES mixture, enables a simplified and fast glycolipid synthesis using directly oleaginous yeast biomass.
Finally, we demonstrate that the DES-like Manuka honey can also serve as a medium for glycolipid synthesis. Indeed, this supersaturated sugar solution can be compared in terms of physicochemical properties to the sugar based DESs. Honey products being commercially available for therapeutic applications, it appears interesting to enhance its bioactivity. In the final chapter of this dissertation, we investigate if enriching medical grade honey with in situ enzymatically synthetized glycolipids can improve the antimicrobial property of the mixture. Tested mixtures are composed of Manuka honey enriched with octanoate, decanoate, laurate and myristate sugar esters respectively dubbed GOH, GDH, GLH and GMH. To characterize the bioactivity of those mixtures, first a qualitative screening using agar well diffusion assay has been performed with methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Candida bombicola, Escherichia coli and Pseudomonas putida which confirmed a considerably enhanced susceptibility of these micro-organisms to the different glycolipid enriched honey mixtures. A designed biosensor E. coli strain that displays a stress reporter system consisting of three stress-specifically inducible, red, green and blue fluorescent proteins which respectively translate physiological stress, genotoxicity and cytotoxicity was then used. The latter allowing bioactivity characterization and showed a six-fold enhancement of the physiological stress caused by GOH compared to regular Manuka honey at 1.6% (v/v) concentration. Antibacterial agar well diffusion assay with E. coli was then performed and demonstrated an improved inhibitory potential with GOH upon 20% (v/v) concentration.
