Abstract:
Monoklonale Antikörper (mAbs) und andere biologische Therapien kommen Millionen von Patienten zugute, die unter schwerwiegenden Krankheiten leiden. Das Spektrum der therapeutischen Bereiche, in denen Biologika eingesetzt werden, umfasst die Onkologie, die Hämatologie, Entzündungskrankheiten und neuerdings auch Infektionskrankheiten wie die Coronavirus-Disease 2019 (COVID-19). Die Herstellung und Materialbereitstellung für präklinische und klinische Studien ist ein wichtiger Baustein in der Entwicklung eines therapeutischen Antikörpers. MAbs und komplexe Antikörperformate werden in Zellkulturprozessen, dem sogenannten Upstream Processing (USP), hergestellt. ... mehrDas anschließende Downstream Processing (DSP) zielt darauf ab, das Zielprotein aus der heterogenen Zellkulturflüssigkeit abzutrennen und zu reinigen. Das DSP von mAbs basiert auf dem Plattformkonzept. Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeiten der verschiedenen mAb-Produkte erfolgt deren Aufreinigung in einer standardisierten Abfolge von Prozessschritten mit antikörperspezifischer Anpassung von Prozessparametern. Hier wird häufig die Kationenaustauschchromatographie (CEX) als Polishing-Schritt eingesetzt, da sie in der Lage ist, produktbezogene Verunreinigungen, wie Größen- und Ladungsvarianten des mAb-Produkts, zu entfernen. Die Adsorption von Proteinen an chromatographischen Medien hängt von der Zusammensetzung der mobilen Phase, der Ligandenstruktur und der Struktur des Zielproteins ab. Während die präparative Chromatographie eine einzigartige Selektivität bei der Abreicherung von produkt- und prozessbedingten Verunreinigungen bietet, widerspricht die komplexe und zeitaufwändige Prozessentwicklung der ursprünglichen Idee des Plattformkonzepts. Das Streben nach einer standardisierten Aufreinigung verschiedener Antikörperprodukte wird zusätzlich durch bispezifische und multispezifische Antikörperformate erschwert, die die strukturelle Heterogenität der biopharmazeutischen Entwicklungspipelines erhöhen. Aufgrund der unbekannten Beziehungen zwischen Proteinstruktur und Adsorptionsverhalten stützen sich aktuelle Entwicklungsstrategien für die präparative Chromatographie auf Hochdurchsatz-Experimente (HTE) und statistische Versuchsplanung (DoE).
Miniaturisierte HTE-Methoden ermöglichen die Untersuchung eines großen Parameterraums innerhalb eines kurzen Zeitrahmens, aber ihre Vergleichbarkeit mit dem Produktionsmaßstab ist begrenzt. In den frühen Phasen der DSP-Entwicklung schränkt der ständige Mangel an Zeit und Proteinmaterial den Einsatz experimenteller Methoden weiter ein. In vielen Fällen sind DoE-Studien in Verbindung mit empirischer Response-Surface-Modellierung nicht in der Lage, die hochgradig nichtlinearen Beziehungen in der präparativen Chromatographie zu erfassen. Aufgrund der Vielzahl von Parametern, die sich potenziell auf die Produktqualität auswirken können, werden die in DoE-Studien untersuchten Prozessparameter häufig auf der Grundlage von Expertenwissen und einer unzureichenden Datenmenge ausgewählt. Eine falsche Auswahl von Prozessparametern kann zu unnötigen Experimenten führen, die die Prozessentwicklung verzögern, oder schlimmer, zu einem schlecht kontrollierten Herstellungsprozess, der nicht in der Lage ist, eine konstante Produktqualität zu gewährleisten.
Mit der Quality by Design (QbD) Initiative fordern die Zulassungsbehörden ein klares Verständnis der Zusammenhänge zwischen Prozessparametern und Produktqualität. Die U.S. Food and Drug Administration (FDA) und andere Aufsichtsbehörden unterstützen ausdrücklich die Verwendung mathematischer Modelle zur Entwicklung gut verstandener Herstellungsprozesse, die eine robuste Produktqualität und eine effiziente Marktversorgung ermöglichen. In den letzten Jahren wurden computergestützte Methoden auf der Grundlage von Homologiemodellierung, quantitativen Struktur-Eigenschafts-Beziehungen (QSPR), maschinellem Lernen und mechanistischer Chromatographiemodellierung entwickelt, um vielseitige Aufgaben in der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung zu unterstützen. Mechanistische Chromatographiemodelle sind in der Lage, nichtlineare Beziehungen zwischen Prozessparametern und kritischen Qualitätsattributen (CQAs) vorherzu-sagen. Die Proteinstruktur ist jedoch die eigentliche Ursache für die Funktionalität eines biologischen Arzneimittels. Diese Arbeit zielt darauf ab die Zusammenhänge zwischen der Proteinstruktur und dem makroskopischen Prozessverhalten zu verstehen, um die strukturbasierte Vorhersage von CQAs für eine verbesserte Herstellung von biologischen Arzneimitteln zu ermöglichen.
Die vorliegende Arbeit besteht aus fünf Manuskripten, die sich mit der Erstellung von strukturbasierten und mechanistischen Modellen für die rationalisierte DSP Entwicklung von therapeutischen Antikörpern befassen. Dies erfordert ein verbessertes Verständnis der Beziehungen zwischen der Proteinstruktur und den makroskopischen Parametern der Adsorptionsisotherme. Lernalgorithmen sollen mit einem umfassenden Datensatz trainiert und validiert werden, der strukturelle Deskriptoren und Isothermenparameter von therapeutischen Antikörpern enthält, die für biopharmazeutische Entwicklungspipelines re-präsentativ sind. Es sollen effiziente Methoden zur Modellkalibrierung, -validierung und \textit{in silico} Prozesscharakterisierung entwickelt werden, die den QbD-Richtlinien gerecht werden. Die Kombination von Homologiemodellierung, QSPR-Modellierung und mechanistischer Chromatographiemodellierung in einem holistischen \textit{in silico}-Werkzeug soll den Weg von der Aminosäuresequenz des Antikörperkandidaten zu einem robusten Produktionsprozess weisen. Das erste Manuskript dieser Arbeit untersuchte den Einfluss von Aminosäuresubstitutionen in der Complementary Determining Region (CDR) eines IgG1 mAb auf sein Elutionsverhalten in der präparativen CEX Chromatographie. Die Aminosäuresubstitutionen wurden eingeführt, um die biophysikalischen Eigenschaften des mAb zu beeinflussen, indem oberflächenexponierte hydrophobe und geladene Bereiche verändert wurden. Zusätzliche positiv geladene Gruppen in den CDR der leichten Kette (L) und der schweren Kette (H) der mAb-Varianten führten zu einem erhöhten Retentionsvolumen bei der linearen Salzgradientenelution im Vergleich zum ursprünglichen Antikörper. Die Substitution von Tryptophan durch Lysin in der H-CDR3 erhöhte die Ladungsheterogenität des Produkts und führte zu einer signifikanten Erhöhung des Elutionspoolvolumens. Eine multiskalige \textit{in silico}-Analyse, bestehend aus Homologiemodellierung, Proteinoberflächenanalyse und mechanistischer Chromatographiemodellierung, entschlüsselte die qualitativen Zusammenhänge zwischen Struktureigenschaften und Parametern der Steric Mass Action Isotherme (SMA). Die gewonnenen Erkenntnisse über die Bindungsorientierung und die Proteinadsorption an starke CEX-Medien bilden das theoretische Fundament für QSPR-Modelle, die Isothermenparameter auf der Grundlage von Antikörperstrukturinformationen vorhersagen.
Im zweiten Manuskript wurde eine QSPR Modellierungsmethode zur Vorhersage von Stoichiometric Displacement Model (SDM) Parametern von therapeutischen mAbs vorgestellt. Das Modell nutzt Proteindeskriptoren, die aus Homologiemodellen abgeleitet wurden und experimentelle Daten mehrerer Antikörperformate, einschließlich IgG1 mAbs, IgG4 mAbs, Fabs sowie bispezifische Antikörper, um Chromatogramme von zwei mAbs vorherzusagen, die aus dem Trainingsdatensatz entfernt wurden. Die Berücksichtigung von zwei diskreten Konformationen bei der Homologiemodellierung von IgG4 mAbs lieferte eine mögliche Erklärung für Split-Peak-Chromatogramme. Mit Hilfe der Gaußprozess-Regression wurde eine quantitative Beziehung zwischen den Proteindeskriptoren und den makroskopischen Parametern der SDM-Isotherme hergestellt. Durch rekursive Feature-Eliminierung wurden Proteindeskriptoren innerhalb der variablen Region von mAbs identifiziert, die für die Vorhersage der thermodynamischen Gleichgewichtskonstante relevant sind. Im Gegensatz dazu, war der charakteristische Ladungsparameter der SDM-Isotherme hauptsächlich von der Gesamtnettoladung der untersuchten Antikörper abhängig. Die ersten beiden Manuskripte zeigten, wie Homologiemodellierung, QSPRs und mechanistische Modellierung die Frühphasen-Entwicklung für ein neues Biopharmazeutikum unterstützen können, auch ohne anfängliches Prozesswissen und Proteinmaterial für Laborversuche. Die Manuskripte drei, vier und fünf bilden eine Publikationsreihe, die darauf abzielt, die Verwendung der mechanistischen Chromatographiemodellierung als QbD-Werkzeug in der Spätphasen-Entwicklung zu fördern. Daher werden in den folgenden Manuskripten optimierte Methoden zur Modellkalibrierung, -validierung und -anwendung vorgestellt.
Im dritten Manuskript wurde eine Methode für die Kalibrierung von multikomponenten SMA Chromatographiemodellen entwickelt. Die mechanistische Modellierung ist eine vielversprechende Technologie für die digitale Bioprozessentwicklung, aber die komplexe und zeitaufwändige Modellkalibrierung hemmt noch immer ihre Anwendung in der biopharmazeutischen Industrie. Für die \textit{in silico}-Prozesscharakterisierung und andere komplexe DSP-Anwendungen müssen Kalibrierungs- und Validierungstechniken zu einer Modellsicherheit führen, die den Anforderungen des QbD-Konzepts gerecht wird. In dieser Studie wurde eine pH-abhängige, multikomponenten SMA-Isotherme verwendet, um einen CEX-Chromatographieprozess zu modellieren, der drei mAb-Ladungsvarianten sowie eine Aggregatspezies beinhaltet. Die Modellkalibrierungsmethode basierte auf der systematischen Reduktion unbekannter Modellparameter durch Anwendung grundlegender Kenntnisse über präparative Chromatographie in Kombination mit der inversen Schätzung von Modellparametern unter Verwendung repräsentativer Experimente. Die Parameter, die den linearen Bereich der SMA-Isotherme definieren, wurden anhand einer Reihe von linearen Gradientenelutionsversuchen ohne Fraktionssammlung bestimmt, was den analytischen Aufwand für die Quantifizierung der Ladungs- und Größenvarianten drastisch reduzierte. Außerdem konnten mit dieser Methode lokale Minima bei der heuristischen Schätzung der übrigen Modellparameter vermieden werden. Die Anreicherung der Aggregatspezies im Ausgangsmaterial reduzierte die Modellunsicherheit für diese niedrig konzentrierte Verunreinigung. Die Modellvalidierung wurde unter Prozessbedingungen durchgeführt, die außerhalb der vorgesehenen Parameterbereiche des CEX-Prozesses lagen. Mit dieser Arbeit wurde eine standardisierte Methode zur Kalibrierung von mechanistischen Chromatographiemodellen eingeführt, die in einem industriellen Umfeld eingesetzt werden kann.
Als Alternative zu experimentellen Scale-Down Modellen (ScDM) wurde im vierten Manu-skript das zuvor vorgestellte mechanistische Chromatographiemodell als digitale Repräsentation des Prozesses im Produktionsmaßstab validiert. Experimentelle ScDMs von Chromatographieprozessen ermöglichen eine wirtschaftliche Prozesscharakterisierung und Ursachenforschung im Labormaßstab. Die Vergleichbarkeit zwischen ScDM Säulen und größeren Maßstäben hängt jedoch von systemspezifischen Dispersionseffekten, der Variabilität der Ligandendichte sowie der Variabilität in der Zusammensetzung des Feed-Materials und der Beladungsdichte ab. Darüber hinaus verlangen die Aufsichtsbehörden, dass mathematische Modelle die Auswirkungen der Prozessvariabilität erfassen, die bei der Herstellung im Großmaßstab zu erwarten sind, wenn das Modell zur Festlegung einer Kontrollstrategie für den kommerziellen Herstellungsprozess verwendet wird. Der Vergleich zwischen simulierten und gemessenen Chromatogrammen und Elutionspooldaten vom Labor- bis zum Produktionsmaßstab ermöglichte die frühzeitige Identifizierung von Unterschieden zwischen den Maßstäben, z.~B. Systemdispersionseffekte oder Variabilität der Ionenkapazität. Es wurde eine mehrstufige Modellvalidierungsmethode eingeführt, um die Modellqualität zu messen und die Grenzen des Modells in verschiedenen Maßstäben zu verstehen. Das experimentelle ScDM und das \textit{in silico}-Modell wurden mit Hilfe des identischen statistischen Äquivalenztestverfahrens als repräsentative Darstellung des Produktionsmaßstabs validiert. Das mechanistische Chromatographiemodell umging die Limitierungen des experimentellen ScDM, indem es die Auswirkungen von Betthöhe, Beladungsdichte, Feed-Zusammensetzung und Eigenschaften der mobilen Phase erfasste. Die Ergebnisse zeigen die Anwendbarkeit mechanistischer Chromatographiemodelle als mögliche Alternative zu konventionellen ScDM-Ansätzen und ermöglichen ihre Verwendung für komplexe Aufgaben in der Spätphasen-Entwicklung.
Das fünfte und letzte Manuskript demonstriert die Anwendung des zuvor veröffentlichten mechanistischen Chromatographiemodells auf die Prozesscharakterisierung (PCS) eines Aufreinigungsschritts. Studien zur Prozesscharakterisierung stellen die umfangreichsten und zeitaufwändigsten Arbeitspakete während der DSP-Entwicklung eines mAbs dar. Im Allgemeinen besteht das Ziel der PCS in der Identifizierung von Korrelationen zwischen Prozessparametern und CQAs, was die Etablierung einer robusten Prozesskontrollstrategie ermöglichen soll. Aufgrund der Komplexität der präparativen Chromatographie und einer Vielzahl von potenziell kritischen Prozessparametern erfordert eine traditionelle PCS auf der Grundlage statistischer DoEs Dutzende von Laborexperimenten sowie zeitintensive Offline-Messungen. Die in dieser Arbeit vorgestellte Modellierungsmethode deckt die Hauptaufgaben traditioneller PCS-Studien nach den QbD-Prinzipien ab, einschließlich der Bewertung der Kritikalität von 11 Prozessparametern und der Festlegung ihrer Kontrollbereiche. Die Analyse der Auswirkungen eines multivariaten Samplings von Prozessparametern auf das Aufreinigungsergebnis ermöglichte die Identifizierung der Edge-of-Failure. Die experimentelle Validierung der \textit{in silico}-Ergebnisse erforderte etwa 75\% weniger Experimente im Vergleich zu einer rein auf Laborexperimenten basierenden PCS. Monte-Carlo-Simulationen wurden unter Berücksichtigung der gemessenen Varianzen der Prozessparameter und der Zusammensetzung des Feed-Materials im Produktionsmaßstab eingesetzt, um die Fähigkeit des Prozesses abzuschätzen, die Akzeptanzkriterien für CQAs und Prozessausbeute zu erfüllen. Der hier vorgestellte Arbeitsablauf ermöglicht die Implementierung digitaler Zwillinge als QbD-Werkzeug für eine verbesserte Entwicklung biopharmazeutischer Herstellungsprozesse.
In der vorliegenden Arbeit wurden mehrere Hindernisse auf dem Weg von der Primärstruktur zur Etablierung eines robusten Downstream-Prozesses beseitigt. Die multiskalige Modellierung mehrerer Biologika in der CEX-Chromatographie führte zu einem tiefen Verständnis der zugrundeliegenden Adsorptionsmechanismen. Die vorgestellten QSPR-Modelle zur Vorhersage von SDM-Isothermen Parametern ermöglichten einen frühen Start der Prozessentwicklung, bevor Proteinmaterial für Laborexperimente zur Verfügung steht. Um die Lücke zwischen der Frühphasen- und Spätphasen-Entwicklung zu schließen, können erste Chromatographiemodelle, die auf Proteinstrukturinformationen aufbauen, mit Hilfe experimenteller Daten weiter verfeinert werden. Im Kontext der QbD-Richtlinien tragen standardisierte und wissenschaftlich fundierte Methoden zur Modellkalibrierung, Validierung und \textit{in silico}-Prozesscharakterisierung zu einer effizienteren und wirtschaftlicheren DSP-Entwicklung bei und erhöhen gleichzeitig die Prozessrobustheit und Produktqualität. Die in dieser Arbeit vorgestellten Werkzeuge haben das Potenzial, die Akzeptanz gegenüber der mechanistischen Modellierung in der Industrie und bei den Aufsichtsbehörden zu erhöhen.
Abstract (englisch):
Monoclonal antibodies (mAbs) and other biological therapies benefit millions of patients fighting severe conditions. The spectrum of therapeutic areas in which biologics can be used includes oncology, hematology, inflammatory diseases, and more recently, infectious diseases such as corona virus disease 2019 (COVID-19). Manufacturing and material supply for pre-clinical and clinical trials forms a major building block in the development of a therapeutic antibody. MAbs and complex antibody formats are produced in cell culture processes, the so-called upstream processing (USP). ... mehrSubsequently, the downstream processing (DSP) aims to capture and purify the target protein from the highly heterogeneous cell culture fluid. The DSP of mAbs is based on the platform concept. Due to the structural similarities of different mAb products their downstream processing is performed in a standardized sequence of unit operations with antibody-specific adaption of process conditions. Here, cation exchange (CEX) chromatography is frequently employed as a polishing step due to its ability to remove product related impurities, such as size- and charge variants of the mAb product. Protein adsorption to chromatographic resins depends on mobile phase conditions, the ligand structure, and the structure of the target protein. While preparative chromatography offers an unparalleled selectivity towards the removal of product- and process-related impurities, the complex and time-consuming process development contradicts the original idea of the platform concept. The pursuit of a standardized purification of different antibody products is further complicated by bispecific and multispecific antibody formats that increase the structural heterogeneity of biopharmaceutical development pipelines. Due to the unknown relationships between protein structure and adsorption behavior, development strategies for preparative chromatography must rely on high-throughput experimentation (HTE) and statistical design of experiments (DoE).
Miniaturized HTE methods enable the investigation of a large parameter space within a short time frame, but their comparability to manufacturing-scale is limited. During the early phases of DSP development, constant shortage of time and protein material further constrains the use of experimental methods. In many cases, wet-lab DoE studies coupled with empirical response surface modeling are not able to capture the highly nonlinear relationships encountered in preparative chromatography. Due to the multitude of parameters that could potentially affect product quality, the process parameters screened in DoE studies are often selected based on subject matter expertise. Incorrect selection of process parameters could lead to unnecessary experimentation delaying process development, or even worse, to a poorly understood manufacturing process incapable of delivering a constant product quality.
With the Quality by Design (QbD) initiative, regulatory authorities have been demanding a clear understanding of correlations between process parameters and product quality. The U.S. Food and Drug Administration (FDA) and other regulatory agencies specifically encourage the use of mathematical models to develop well-understood manufacturing processes that enable robust product quality and efficient market supply. During the last years, computational tools based on homology modeling, quantitative structure-property relationships (QSPR), machine learning, and mechanistic chromatography modeling were developed to support various tasks in biopharmaceutical research and development. Mechanistic chromatography models are capable of predicting non-linear relationships between process parameters and critical quality attributes (CQAs). However, the protein structure is the ultimate root cause for the functionality of a biological drug. This work intends to close the gap between protein structure and macroscopic process behavior to enable the structure-based prediction of CQAs for an improved manufacturing of biological drugs.
The present work consists of five manuscripts that focus on the development of structure-based and mechanistic models for the rationalized DSP of therapeutic antibodies. This demands an increased understanding of the relationships between protein structure and macroscopic adsorption isotherm parameters. Machine learning models should be trained and tested with a data set that includes structural descriptors and adsorption isotherm parameters of a diverse set of therapeutic antibodies representative for biopharmaceutical development pipelines. Efficient model calibration, validation, and process characterization methods for mechanistic models should be developed that cope with the QbD guidelines. A combination of homology modeling, QSPR modeling, and mechanistic chromatography modeling into a common multiscale \textit{in silico} framework should guide the path from the amino acid sequence of the antibody candidate to a robust manufacturing process. The first manuscript of this thesis elucidated the influence of amino acid substitutions in the complementarity-determining region (CDR) of a full-length IgG1 mAb on its elution behavior in preparative CEX chromatography. The amino acid substitutions were introduced to affect biophysical properties of the mAb by modifying surface-exposed hydrophobic and charged patches. Additional positively charged groups in the light chain (L) and heavy chain (H) CDR of mAb variants resulted in an increased retention volume in linear salt gradient elution compared to the original antibody. Substitution of tryptophan with lysine in the H-CDR3 increased charge heterogeneity of the product leading to a significant increase of elution pool volume. A multiscale \textit{in silico} analysis, consisting of homology modeling, protein surface analysis, and mechanistic chromatography modeling revealed qualitative relationships between structural descriptors and macroscopic parameters of the steric mass-action (SMA) adsorption isotherm. The insights gained into binding orientation and protein adsorption to strong CEX media provide the theoretical basis for QSPR models that predict isotherm model parameters based on antibody structure information.
The second manuscript introduced a QSPR modeling method for prediction of stoichiometric displacement model (SDM) isotherm parameters of therapeutic mAbs. The model leverages protein descriptors derived from homology models and experimental data of multiple antibody formats, including IgG1 mAbs, IgG4 mAbs, Fabs, as well as bispecific antibodies, to predict chromatograms of two mAbs that were removed from the training data set. Consideration of two discrete conformations during homology modeling of IgG4 mAbs gave a possible explanation for split-peak chromatograms. Gaussian process regression was used to build quantitative relationships between protein descriptors and macroscopic SDM isotherm parameters. Recursive feature elimination identified protein descriptors within the variable region of mAbs relevant for prediction of the thermodynamic equilibrium constant. In contrast, the characteristic charge parameter of the SDM isotherm was mainly depending on the overall net charge of investigated antibodies. The first two manuscripts showed how homology modeling, QSPRs, and mechanistic modeling can support early-stage development of a new biological entity without initial process knowledge and protein material for wet-lab experiments. Manuscripts three, four, and five form a publication series, which aims to foster the adoption of mechanistic chromatography modeling as QbD-tool in late-stage biopharmaceutical development. Therefore, the manuscripts introduce straightforward methods for model calibration, validation, and application.
In the third manuscript, a novel method for the calibration of multicomponent SMA chromatography models was developed. While mechanistic modeling is a promising technology for digital bioprocess development, the complex and time-consuming model calibration still inhibits its application in the biopharmaceutical industry. For \textit{in silico} process characterization and other demanding late-stage DSP applications, calibration and validation techniques must result in a model certainty that meets the requirements of the QbD concept. In this study, a multicomponent, pH-dependent SMA isotherm was used to model a CEX chromatography process including three mAb charge variant, as well a high molecular weight species. The model calibration method was based on the systematic reduction of unknown model parameters by applying fundamental knowledge on preparative chromatography in combination with the inverse estimation of model parameters using a representative set of wet-lab experiments. Parameters defining the linear region of the SMA isotherm were estimated using a set of linear gradient elution experiments without fraction collection, which drastically reduced the analytical efforts for quantification of mAb charge- and size-variants. Further, this methodology avoided local minima during the heuristic estimation of the remaining model parameters. Enrichment of the aggregate species in the loading material reduced model uncertainty for this low-concentrated impurity. Model validation was performed at laboratory-scale at process conditions beyond the intended operating ranges of the purification process. This work introduced a standardized method for calibration of mechanistic chromatography models that can be used economically and efficiently in an industrial setting.
As an alternative to experimental scale down models (ScDM), the fourth manuscript validated the previously presented mechanistic chromatography model as a digital representation of the large-scale manufacturing process. Experimental ScDMs of chromatography processes enable an economic process characterization and root cause investigation at laboratory-scale. However, the comparability between ScDM columns and larger scales depends on system-specific dispersion effects, resin variability, as well as variability in feed composition and loading density. Additionally, regulatory authorities require that mathematical models capture the effects of process variability anticipated at large-scale manufacturing if the model is used to establish a control strategy for the commercial manufacturing process. Comparison between simulated and measured chromatograms and elution pool data ranging from laboratory- to manufacturing-scale allowed early identification of differences between scales, e.g. system dispersion effects or ionic capacity variability. A multi-stage model validation approach was introduced to measure the model quality and to understand the model’s limitations across scales. The experimental ScDM and the \textit{in silico} model were qualified against large-scale data using the identical statistical equivalence testing procedure. The mechanistic chromatography model avoided limitations of the ScDM by capturing effects of bed height, loading density, feed composition, and mobile phase properties. The results demonstrate the applicability of mechanistic chromatography models as a possible alternative to conventional ScDM approaches enabling their application to advanced tasks in late-stage DSP development.
The fifth and final manuscript demonstrates the application of the previously published mechanistic chromatography model to the \textit{in silico} process characterization (PCS) of a monoclonal antibody polishing step. Process characterization studies represent the most comprehensive and time-consuming work-packages during the downstream process development of a mAb. In general, the aim of a PCS is the identification of correlations between process parameters and product quality enabling the definition of a robust process control strategy. Due to the complexity of preparative chromatography and a plethora of potentially critical process parameters, a traditional PCS based on statistical DoEs requires dozens of wet-lab experiments as well as off-line analytical measurements. The modeling workflow presented in this study covered the main tasks of traditional PCS studies following the QbD principles, including criticality assessment of 11 process parameters and establishment of their proven acceptable ranges (PARs) of operation. Analyzing effects of multi-variate sampling of process parameters on the purification outcome allowed identification of the edge-of-failure. Experimental validation of \textit{in silico} results demanded approximately 75\% less experiments compared to a purely wet-lab based process characterization study. Monte-Carlo simulation, considering the measured variances of process parameters and loading material composition at manufacturing-scale, was used to estimate the capability of the process to meet the acceptance criteria for critical quality attributes and key performance indicators. The proposed workflow enables the implementation of digital process twins as QbD tool for improved development of biopharmaceutical manufacturing processes.
The present thesis removed several roadblocks on the way from the primary structure to establishing a robust downstream process. Multiscale modeling of a diverse set of biologics in CEX chromatography led to a deep understanding of the underlying adsorption mechanisms. The presented QSPR models for prediction of SMA adsorption isotherm parameters enabled an early start of process development before protein material for wet-lab experiments is available. To close the gap between early- and late-stage development, initial chromatography models built on protein structure information can be further refined using experimental data that is collected during the product life cycle. In the light of the QbD concept, standardized and scientifically sound methods for model calibration, validation, and \textit{in silico} process characterization contribute to a more efficient and economic DSP development, while increasing process robustness and product quality. The tools introduced in this thesis have the potential to increase the acceptance of mechanistic modeling by industry and regulatory agencies.
