Abstract:
In den letzten Jahren ist der Bedarf an Materialien aus erneuerbaren Ressourcen gestiegen, was zu großen Fortschritten auf dem Gebiet der proteinbasierten Materialien geführt hat. Derzeit konzentriert sich die Forschung in diesem Feld dabei insbesondere auf Anwendungen im medizinischen Bereich, da Proteine und Peptide in der Regel biokompatibel und biologisch abbaubar sind und über spezifische, auf Stimuli reagierende Materialeigenschaften verfügen. Fortschritte in der Rekombinationstechnologie für Desoxyribonukleinsäure (DNA) ermöglichten die Entwicklung von Polymeren auf Peptidbasis, die auf natürlichen Vorbildern basieren. ... mehrEin Beispielmolekül, das in dieser Dissertation verwendet wird, sind elastinähnliche Proteine (ELPs), die das Tropoelastin von Säugetieren nachahmen. Obwohl sie für das Design neuer proteinbasierter Materialien mit gewünschten Eigenschaften von entscheidender Bedeutung sind, sind die Einflussparameter während der Formulierung und Lagerung, die die mechanischen Eigenschaften der gebildeten Hydrogele bestimmen, sowie die der Bildung von Proteinnetzwerken zugrunde liegende Physik nach wie vor kaum verstanden.
Das Ziel dieser Arbeit ist es, das Verständnis von proteinbasierten Hydrogelen während ihrer Formulierung, Charakterisierung und Verarbeitung zu verbessern. Neben der Entwicklung von dityrosinvernetzten proteinbasierten Hydrogelformulierungen für Homo- und Copolymere aus natürlich vorkommenden Proteinen und eines künstlich hergestellten ELPs, wurden im Rahmen dieser Arbeit auch verschiedene weitere Herausforderungen im Zusammenhang mit proteinbasierten Hydrogelen behandelt. Damit proteinbasierte Hydrogele aus rekombinant exprimierten ELP gebildet werden können, wurde zunächst deren Herstellung untersucht, indem drei Aufreinigungsprozesse für ein hydrophobes ELP-Konstrukt mit niedrigem Temperaturübergang durchgeführt und bewertet wurden. Im Formulierung- und Prozessierungsteil dieser Arbeit wurde eine neuartige Tinte für den Extrusionsdruck von unmodifiziertem Kasein entwickelt, um die prinzipielle Anwendbarkeit der additiven Fertigung zur Funktionalisierung und Verarbeitung des Hydrogelmaterials zu demonstrieren. Zur Charakterisierung der entwickelten Materialien wurden herkömmliche makroskopische Methoden wie Rheometrie, Kompression und gewichtsbasiertes Quellverhalten angewandt. Mit der Magnetresonanztomographie wurde eine zerstörungsfreie Analysestrategie mit hoher räumlicher Auflösung etabliert, um das Quellverhalten von Hydrogelen zu überwachen. Mit diesem Ansatz konnte die Flüssigkeitsaufnahme und das Quellverhalten von Hydrogelen, die in Flüssigkeiten mit komplexer Zusammensetzung hergestellt und gequollen wurden, sowie das Verhalten komplexer Hydrogelgeometrien beschrieben werden, was besonders für die Charakterisierung funktionalisierter Hydrogelmaterialien nützlich ist.
Die drei Themen Formulierung, Charakterisierung und Verarbeitung wurden in insgesamt fünf Studien mit dityrosinvernetzten Hydrogelen auf Proteinbasis aus unterschiedlichen Perspektiven behandelt. In einer ersten Studie wurden drei verschiedene Aufreinigungsprozesse für ein neuartiges, künstlich entwickeltes hydrophobes ELP-Konstrukt, das in Einschlusskörpern in Escherichia coli exprimiert wurde, untersucht. Neben dem Ziel einer hohen Zielausbeute und Reinheit, sowie eines wirtschaftlichen und skalierbaren Prozessdesigns wurden zusätzlich der Salzgehalt der Formulierung und der Nukleinsäuregehalt betrachtet. Die Aufreinigung des mit Hexahistidin markierten ELP-Konstrukts mit einer unteren kritischen Lösungstemperatur (LCST) unterhalb der Raumtemperatur in Wasser wurde durch Homogenisierung und Auflösung der Einschlusskörper begonnen, entweder gefolgt von einer Hochsalzfällung, einer Kombination aus Hochsalzfällung und einem Zyklus des inverse transition cycling (ITC) oder einer immobilisierten Metallaffinitätschromatographie (IMAC) in Kombination mit einer Größenausschlusschromatographie. Die Methode der Hochsalzfällung hatte die höchste Ausbeute an Zielmolekülen, aber eine geringe Reinheit (60 %) und eine höhere Nukleinsäurekontamination und höheren Salzgehalt in der Endformulierung. Die ITC-Methode erhöhte die Reinheit und die Nukleinsäureentfernung, verringerte aber auch die Gesamtausbeute um 17 bis 34 % während des Niedrigtemperaturzentrifugationsschritts in Abhängigkeit von der angewandten Zentrifugationszeit aufgrund der niedrigen LCST-Temperatur des verwendeten ELP-Konstrukts. IMAC hatte eine vergleichbare Reinheit und eine etwas geringere Ausbeute, aber auch eine höhere Nukleinsäureentfernung. Unter Berücksichtigung der skalenabhängigen Kosten und dem Ziel, Material für biomedizinische Anwendungen zu erzeugen, sollte ITC (hohe Prozessierungskosten aufgrund der temperaturabhängigen Zentrifugationsschritte) gegen IMAC (hohe Investitionskosten) abgewogen werden, während die salzinduzierte Fällung aufgrund ihrer hohen Ausbeute und Einfachheit eine Option für Massenanwendungen sein könnte.
Vor der Polymerisation von proteinbasierten Hydrogelen aus diesem ELP-Konstrukt, wurde eine Studie mit einem allgemeineren Ansatz durchgeführt. Ziel der Studie war es, zu verstehen, wie die Art und die Eigenschaften des Proteins in Kombination mit den Formulierungsbedingungen die mechanischen Eigenschaften der dityrosinvernetzten Hydrogele beeinflussen. Die unmodifizierten, handelsüblichen Proteine Rinderserumalbumin (BSA) und Kasein wurden unter verschiedenen Bedingungen vernetzt, wobei das photoinitiierende System konstant gehalten wurde. Die resultierenden Hydrogelnetzwerke wurden in Puffersystemen mit oder ohne externe Stimuli gelagert und die Hydrogele auf ihre mechanischen Eigenschaften hin untersucht. Die Proteinfaltung und damit die dreidimensionale (3D) Anordnung und die Oberflächenverfügbarkeit der Aminosäurereste wurden durch Zugabe verschiedener Harnstoffkonzentrationen zum Formulierungspuffer variiert und der Speichermodul sowie der Verlustfaktor mit oszillierender Rheometrie gemessen. Höhere Harnstoffkonzentrationen verstärkten die strukturelle Festigkeit und Elastizität des Hydrogels, wobei die genauen zugrunde liegenden Mechanismen, die für diesen Effekt verantwortlich sind, unklar bleiben. Der Speichermodul, die Bruchdehnung und die Druckfestigkeit nahmen mit der Proteinkonzentration zu, während die Elastizität ein konzentrationsabhängiges Maximum bei 60 mg/ml BSA aufwies und die Bruchdehnung oberhalb von 80 mg/ml BSA nicht weiter anstieg. In der letzten Teilstudie wurden das rheologische Verhalten und das gewichtsbezogene Quellungsverhältnis von Hydrogelen, die entweder 100 mg/ml Casein oder BSA enthielten, in Abhängigkeit von der Harnstoffkonzentration und der Nettoladung des BSA-Proteins bei verschiedenen pH-Werten der Formulierung untersucht. Die sich daraus ergebenden Hydrogeleigenschaften waren vom Protein und vom Lagermedium abhängig, was die Bedeutung der Formulierungskomponenten für die Entwicklung der
gewünschten mechanischen Eigenschaften von dityrosinvernetzten Hydrogelen auf Proteinbasis hervorhebt.
Um die große Vielfalt der potenziell vernetzbaren Proteine zu demonstrieren, wurden diese Methoden im weiteren Verlauf auf insgesamt vier Proteine angewandt, die vom intrinsisch ungeordneten ELP-Konstrukt bis zu BSA mit einer geordneten Tertiärstruktur reichen. Diese Proteine wurden verwendet, um entweder dityrosinvernetzte Homo- oder Copolymerhydrogele herzustellen, wobei die Proteine in unterschiedlichen Verhältnissen gemischt wurden. Die rheologischen Eigenschaften der resultierenden homopolymeren Hydrogelnetzwerke unterschieden sich je nach Proteincharakteristik, während die Eigenschaften durch Kompressionsversuche für alle Proteinkonstrukte vergleichbar waren. Das zweite Ziel dieser Studie war es, eine Möglichkeit zu finden, die mechanischen Eigenschaften von dityrosinvernetzten Hydrogelen zu modifizieren, ohne den spezifischen Einfluss bestimmter Proteineigenschaften auf das resultierende Hydrogelnetzwerk zu bestimmen, da dies aufgrund der vielen Faktoren, die zwischen den chemisch komplexen Proteinmolekülen variieren, schwierig ist. Zu diesem Zweck wurden Copolymerhydrogele polymerisiert, indem je zwei der vier Proteine vor der Vernetzung in zwei verschiedenen Pufferbedingungen gemischt wurden, wobei die Gesamtsumme der Aminosäuren durch Verwendung gewichtsabhängiger Konzentrationen konstant gehalten wurde. Die rheologischen Eigenschaften dieser copolymeren Hydrogele waren von den gemischten Proteintypen und -konzentrationen abhängig, wobei die Druckfestigkeit und die Zähigkeit des Hydrogels bei kaseinhaltigen Mischungen im Vergleich zu den entsprechenden Homopolymeren am höchsten waren. Insgesamt konnte innerhalb der Grenzen der Studie gezeigt werden, dass es möglich ist, die mechanischen Eigenschaften von dityrosinvernetzten Hydrogelen auf Proteinbasis zu verändern, indem copolymere Hydrogele aus verschiedenen Proteinen mit bekannten Eigenschaften ihrer homopolymeren Hydrogele hergestellt werden. Damit steht mit dieser Methodik ein einfaches Werkzeug für das gezielte Design mechanischer Eigenschaften von Hydrogelen auf Proteinbasis für spezifische Anwendungen zur Verfügung.
Für die Verarbeitung biobasierter Materialien ist eine mögliche Option die additive Fertigung, eine Methode zur schichtweisen Herstellung von 3D-Objekten mit komplexen Geometrien. Die meisten Tintenformulierungen für biobasierte Materialien beruhen auf modifizierten chemischen Substanzen. Ein Vorteil der photoinduzierten Dityrosinvernetzung ist, dass dadurch unter anderem der extrusionsbasierte Druck von unmodifizierten Proteinen möglich sein kann. In einer weiteren Studie wurde eine photopolymerisierbare Tintenformulierung auf der Grundlage des natürlich vorkommenden Proteins Kasein für den Extrusionsdruck entwickelt. Diese Tinte wird durch Mischen des Proteins, des Photoinitiatorsystems, eines Puffers und eines Verdickungsmittels zur Erhöhung der Extrudierbarkeit der Tintenlösung hergestellt. Die Studie zeigte, dass die Herstellbarkeit einer solchen Tinte stark von dem verwendeten Verdickungsmittel und dem verwendeten Mischverfahren abhängt. Insgesamt wurden acht verschiedene Verdickungsmittel getestet, um das am besten geeignete zu finden, das die Viskosität der gemischten Tinte erhöht, ohne dass es zu einer irreversiblen Schaumbildung oder einer Hemmung der Polymerisation formstabiler Hydrogele kommt. Für die entwickelte Tintenformulierung erwies sich Natriumalginat als das wirksamste Verdickungsmittel und wurde für den Druck funktionalisierter Hydrogelstrukturen mit bis zu 30 Schichten verwendet.
Neben der Verarbeitung zu funktionalisierten Hydrogelstrukturen ist das Verständnis und die Charakterisierung der zeitabhängigen stimulusabhängigen Verhaltens solcher Hydrogele wichtig in der Entwicklung für ihre potenziellen Anwendungen. Hydrogele können aus mehreren Komponenten bestehen, wobei Salze und Puffersubstanzen mehr als die Hälfte des Trockengewichts des Hydrogels im Ausgangszustand ausmachen können. Diese Eigenschaften können eine aussagekräftige Interpretation gängiger Analysemethoden, wie z. B. gewichtsbasierter Quellungsquotienten, erschweren. Die Magnetresonanztomographie (MRI) ist eine zerstörungsfreie Technik, die eine räumlich aufgelöste 3D-Untersuchung von weichen Materialien ermöglicht. Die zuvor entwickelte Tintenformulierung wurde als eine auxetische Struktur gedruckt, getrocknet, um vergleichbare Probenbedingungen zu schaffen, und ihr Flüssigkeitsaufnahme- und Quellverhalten in verschiedenen Flüssigkeiten mittels MRI untersucht. Es zeigte sich, dass das Verhalten des Hydrogels je nach Flüssigkeit, in die es eingetaucht war, unterschiedlich war. Diese Studie zeigte das Potenzial des Einsatzes von MRI zur Untersuchung komplexer struktureller Veränderungen von Hydrogelen, zur
Überwachung der Aufnahme von Flüssigkeit in das Hydrogel und der stimulusabhängigen Hydrogelreaktion.
Diese Arbeit hat durch ein tieferes Verständnis der Faktoren, die die Hydrogelformulierung unter Verwendung der durch sichtbares Licht induzierten Dityrosinvernetzung beeinflussen, den Grundstein für die gezielte Entwicklung von Hydrogelen auf Proteinbasis gelegt. Darüber hinaus wurde ein tiefes Verständnis des Produktionsprozesses eines hydrophoben elastinähnlichen Proteins gewonnen, was dazu beitragen wird, die Produktion dieser Proteinklasse effizienter und kostengünstiger zu gestalten. Die maßgeschneiderte Verarbeitung der entwickelten Materialien durch Extrusionsdruck ermöglicht die Herstellung funktionalisierter Hydrogele mit maßgeschneiderten mechanischen Eigenschaften. Um komplexe Prozesse in diesen funktionalisierten Hydrogelen zu untersuchen, kann MRI eingesetzt werden. Ihr Potenzial wurde durch die Überwachung des zeitabhängigen Flüssigkeitsaufnahme und Quellverhaltens von auxetischen Hydrogelstrukturen gezeigt.
Abstract (englisch):
In recent years, there has been an increasing need for materials derived from renewable resources like proteins which has led to a lot of progress in the emerging field of protein-based materials. Right now, research in this field is focused on the development of potential applications in medical purposes, as proteins and peptides are expected to be biocompatible and biodegradable combined with specific, stimuli-responsive material characteristics. Also, advances in recombinant technologies for deoxyribonucleic acid (DNA) enabled the development of engineered peptide-based polymers based on natural role models. ... mehrOne example molecule that is enclosed in this dissertation are elastin-like proteins (ELPs) mimicking mammalian tropoelastin. Even though they are crucial for the design of new protein-based materials with desired properties, the influencing parameters during formulation and storage which are determining the mechanical properties of the formed hydrogels, as well as the physics underlying the formation of protein networks remain poorly understood.
The purpose of this thesis is, to increase our understanding of protein-based hydrogels during their formulation, characterization, and processing. In addition to the development of dityrosine-crosslinked protein-based hydrogel formulations for homo- and copolymers made from naturally occurring proteins and an artificially derived ELP, several challenges associated with protein-based hydrogels were addressed within this thesis. To obtain protein-based hydrogels from recombinantly expressed ELPs, their processing was examined by performing and evaluating three purification routes for a hydrophobic ELP construct with low temperature transition. In the formulation part of this work, a novel ink for extrusion printing of unmodified casein was established to demonstrate the general feasibility of using additive manufacturing to functionalize and process the hydrogel material. For the characterization of the developed materials, traditional macroscopic methods such as rheometry, uniaxial compression and weight-based swelling ratios were applied. With magnetic resonance imaging, a non-destructive analytical strategy with a high spatial resolution was established to monitor the swelling behavior of hydrogels. Using this approach, even the wetting and swelling behavior of hydrogels prepared or swollen in liquids with complex composition as well as the behavior of complex hydrogels geometries could be described, being particularly useful for the characterization of functionalized hydrogel materials.
The three topics formulation, characterization and processing were covered from different perspectives with dityrosine-crosslinked protein-based hydrogels in a total of five studies. In an initial study, three different purification routes of a novel, artificially designed hydrophobic ELP construct expressed in inclusion bodies in Escherichia coli were evaluated. With the objective of high target yield and purity as well as economic and scalable process design, formulation salinity and nucleic acid content were screened. The ELP construct, hexahistidine-tagged and with a lower critical solution temperature (LCST) below room temperature in water, was purified using homogenization and inclusion body dissolution, either followed by high-salt precipitation, the combination of high-salt precipitation and one cycle of inverse transition cycling (ITC) or immobilized metal affinity chromatography (IMAC) in combination with a size-exclusion chromatography. The high-salt precipitation method had the highest yield of the target molecule, but low purity (60 %) and higher nucleic acid contamination and salinity. The ITC method increased purity and nucleic acid removal, but also reduced overall yield by 17 – 34 % during the cold spin centrifugation step as a function of the applied centrifugation time due to the low LCST temperature of the ELP construct used. IMAC had comparable purity and a slightly lower yield, but also higher nucleic acid removal. When considering scale-dependent costs and the aim to generate material for biomedical applications, ITC (high processing costs due to temperature-dependent centrifugation steps) should be weighed against IMAC (high investment costs), while salt-induced precipitation could be an option for bulk application due to its high yield and simplicity.
Before polymerizing protein-based hydrogels with the obtained ELP construct, a study with a more general approach was conducted. The aim of the study was to understand how the type and characteristics of protein in combination with formulation conditions affect the mechanical properties of dityrosine-crosslinked hydrogels. Unmodified, commercially available proteins bovine serum albumin (BSA) and casein were crosslinked under different conditions while keeping the photoinitiating system constant. The resulting hydrogel networks were stored in buffer systems with or without external stimuli applied to the network and the hydrogels analyzed for their mechanical properties. The protein folding and thus the three-dimensional (3D) arrangement and amino acid residue surface availability was varied by adding different urea concentrations to the formulation buffer and measuring the storage modulus and loss factor with oscillatory rheometry. Higher urea concentrations increased the structural strength and elasticity of the hydrogel with the exact underlaying mechanisms responsible for this effect remaining unclear. The storage modulus, fracture strain, and compressive strength all increased with protein concentration, with a concentration-dependent maximum elasticity at 60 mg/ml and the fracture strain not further increasing above 80 mg/ml. In the final substudy, the rheological behavior and weight-based swelling ratio of hydrogels containing either 100 mg/ml casein or BSA were assessed as a function of urea concentration and the net charge of BSA protein at different preparation pH values. The resulting hydrogel properties were dependent on the protein and storage medium, highlighting the importance of formulation components for the development of the desired mechanical properties of dityrosine-crosslinked protein-based hydrogels.
To demonstrate the wide variety of potentially crosslinkable proteins, these methods were also applied to four proteins ranging from the intrinsically disordered ELP construct to BSA with an ordered tertiary structure. These proteins were used to create either homopolymeric or copolymeric dityrosine-crosslinked protein-based hydrogels mixed in different ratios. The rheological properties of the resulting homopolymeric hydrogel networks differed based on the protein characteristics, while the uniaxial compression properties were comparable for all protein constructs. The second goal of this study was to find a sample way to modify the mechanical properties of dityrosine-crosslinked hydrogels, without determining the specific influence of specific protein properties on the resulting hydrogel network, which is difficult due to the many factors that vary between chemical complex protein molecules. To do this, copolymeric hydrogels were polymerized by mixing two of the four proteins in two different buffer conditions prior crosslinking, keeping the total sum of amino acids constant by using weight-dependent concentrations. The rheological properties of these copolymeric hydrogels were dependent on the mixed protein types and concentrations, with the compressive strength and hydrogel toughness peaking for mixtures containing casein compared to their related homopolymers. Overall, within the limitations of the study, the feasibility to modify the mechanical properties of dityrosine-crosslinked protein-based hydrogels by creating copolymeric hydrogels of different proteins with known properties of their homopolymeric hydrogels, was demonstrated. This provides a simple tool for the prospective design of protein-based hydrogels for specific applications.
For the processing of bio-based materials, additive manufacturing with the ability of a layerwise generation of 3D objects with complex geometries is an emerging field. Currently, most ink formulations for bio-based materials rely on modified chemical substances. As one advantage, the photoinduced dityrosine-crosslinking potentially allows the extrusion-based printing of unmodified proteins. In one study, a photopolymerizable ink formulation based on the naturally occurring protein casein was developed for extrusion printing. This ink is made by mixing the protein, the photoinitiating system, buffer and a thickening agent to increase extrudability of the ink solution. The study showed, that the ability to manufacture such an ink heavily depends on the thickening agent and mixing procedure used. In total, eight different thickening agents were tested to find the most suitable one for increasing the viscosity of the mixed ink without introducing irreversible foaming of inhibition of the formation of stable hydrogels. For the developed ink formulation, sodium alginate was found to be the most effective thickening agent and was further used for printing functionalized hydrogel structures with up to 30 layers.
Besides the processing into functionalized hydrogel structures, the understanding and characterization of the time-dependent stimuli-responsiveness of such hydrogel is important during the development for their potential applications. Hydrogels may consist of multiple components, with salts and buffer substances accounting for more than half of the as-prepared hydrogel dry weight. These characteristics can be challenging for a meaningful interpretation of common analytical methods such as weight-based swelling ratios. Magnetic resonance imaging (MRI) is a non-destructive technique that allows for the spatially resolved 3D study of soft materials. The previously established ink formulation was 3D printed to form an auxetic geometry, dried to create comparable sample conditions, and its wetting and swelling behavior in different liquids examined using MRI. The behavior of the hydrogel was found to be different depending on the liquid it was immersed in. This study demonstrated the potential of using MRI to study complex hydrogel structural changes, monitor the immersion of liquid into, and the stimuli-dependent hydrogel reaction of hydrogels.
This work has laid the foundation for creating a tool for the development of protein-based hydrogels through a deeper understanding of the factors that influence hydrogel formulation using visible light-induced dityrosine crosslinking. An in-depth understanding of the production process of a hydrophobic elastin-like protein has also been gained, which will help to make the production of this class of proteins more efficient and cost-effective. Customized processing of the developed materials via extrusion printing allows for the creation of functionalized hydrogels with customized mechanical properties. To study complex processes in these functionalized hydrogels, MRI can be applied. Its potential was shown by monitoring the time-dependent wetting and swelling behavior of auxetic hydrogel structures.
