In vitro Rekonstruktion des Lebersinusoids im mikrofluidischen Organ-on-a-Chip System als humanes Modell zur verbesserten Wirkstoffentwicklung

Ungefähr 40 % aller potenziellen Wirkstoffkandidaten für den Menschen werden auf Grund von Leberschäden verworfen. Dies geschieht häufig erst zu einem späten Zeitpunkt in der klinischen Testphase und zeigt, dass ein deutliches quantitatives Defizit in dem Vorhersagepotential von präklinischen Modellen besteht. Diese Unzuverlässigkeit in der präklinischen Phase kann zum einen durch die speziesspezifischen metabolischen Unterschiede zu Tiermodellen erklärt werden. Zum anderen wird in der herkömmlichen 2D-Zellkultur die natürliche 3D-Mikroumgebung sowie weitere physiologische Parameter der jeweiligen Zellen im Gewebe nicht korrekt nachgebildet, wodurch eine humane Lebertoxizität von potenziellen Wirkstoffen innerhalb der Medikamentenentwicklung erst während der klinischen Phase detektiert werden kann. Mit biochemischen Verfahren aus der artifiziellen Geweberekonstruktion, dem Tissue Engineering, können die Defizite der weit verbreiteten 2D-Zellkultur überwunden und die Aussagekraft von in vitro Modellen erhöht werden. Ein großer Bereich des Tissue Engineerings umfasst sogenannten Organ-on-a-Chip Systeme. Dies sind Modelle, welche eine in vitro Rekonstruktion menschlicher Organstrukturen auf zellulärer Ebene erlauben. ... mehrOrgan-on-a-Chip Systeme ermöglichen neben einer Dreidimensionalität auch einen artifiziellen, mikrofluidischen Blutstrom, wodurch vaskuläre Eigenschaften im Modellsystem nachgebildet werden können was in einer verbesserten, naturgetreuen Wirkstofftestung resultiert.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die funktionelle Einheit der Leber, das Sinusoid, in einem Organ-on-a-Chip System, dem vasQchip, rekonstruiert. Der vasQchip besteht aus zwei Kompartimenten, einem porösen halbrunden Mikrokanal und einem umgebenden Kompartiment. Der Mikrokanal eignet sich aufgrund der Integration eines artifiziellen Blutflusses hervorragend für die Nachbildung von Blutgefäßen der Leber, während in das umgebende Kompartiment leberspezifische 3D-Gewebestrukturen eingebracht werden können.
Für die Rekonstruktion der Leber wurden in dieser Dissertation ausschließlich primär modifizierte humane Leberzellen verwendet, um ein möglichst naturgetreues humanes Lebermodell aufzubauen. Daneben wurden auch pluripotente Stammzellen in einer Leberzelldifferenzierung eingesetzt. Für die Validierung der Methode wurde zunächst das Verhalten der primären Leberzellen in herkömmliche 2D-Zellkulturen in verschiedenen Nährmedien und unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen mithilfe von quantitativen mRNA-Expressionsanalysen (RT-qPCR) und Immunfluoreszenzanalysen leberspezifischer Proteine analysiert. Neben der Untersuchung der Metabolisierungskapazität von Glucose und verschiedenen Fettsäuren, wurde auch die Lebertoxizität von Ethanol und zytostatischen Molekülen untersucht. Die vorgenommenen Untersuchungen beinhalteten die Charakterisierung der Barrierefunktion des leberspezifischen Endothels in einer Kokultur mit Hepatozyten wofür unter anderem TEER-Messungen eingesetzt wurden. Weiter wurde durch Optimierung der Kultivierungsbedingungen und Besiedelungsmethode die Etablierung der LSEC in Kombination mit einer mikrofluidischen Strömung im Mikrokanal des vasQchips ermöglicht. Expressionsanalysen und immunhistochemische Markierungen mit anschließender konfokalmikroskopischer Visualisierung bestätigten einen positiven Einfluss des mikrofluidischen Flusses auf die LSEC. Die parenchymalen Hepatozyten der Leber konnten erfolgreich im umgebenden Kompartiment des vasQchips eingebracht und hinsichtlich ihrer metabolischen Aktivität von CYP3A4 untersucht werden. Nach Validierung der Kokultur von LSEC und Hepatozyten im mikrofluidischen vasQchip bezüglich der Zellviabilität und des Expressionsverhaltens bedeutsamer Leberproteine konnte ein signifikanter Vorteil in der Zellviabilität des fluidisch kultivierten Lebermodells gegenüber einem statischen Modell bestätigt werden. Für das implementierte Lebermodell konnte eine 7-tägige bis 3-wöchige Kultivierungszeit erzielt werden. Darüber hinaus konnte mit Hilfe einer gelatinebasierten Stützmatrix, einem photovernetzbarem GelNB/GelS-Hydrogel, ein 3D-Hepatozytengewebe im umgebenden Kompartiment aufgebaut werden. Das validierte Lebermodell im vasQchip wurde zur Lebertoxizitätsanalyse des Analgetikums Paracetamol und des Antibiotikums Rifampicin eingesetzt. So konnte eine dosisabhängige Reaktion von Paracetamol mit induzierter toxischer Überdosis beobachtet werden. Ebenfalls wurden im Rahmen dieser Dissertation leberspezifische Peptoide synthetisiert und auf Toxizität und deren Wirkungsort in den etablierten Lebermodellen untersucht. So wurde ein vielversprechendes Peptoid als potenzielles Anti-Krebstherapeutikum im mikrofluidischen Lebermodell identifiziert. Zusätzlich wurden erste Schritte unternommen um das Krankheitsbild der nicht-alkoholischen Fettleber ausgehend von einem gesunden Lebermodell zu rekonstruieren, indem Hepatozyten (in einer 2D- und 3D-Zellkultur) mit einem fettsäurehaltigem Nährmedium behandelt wurden. Durch Analyse des Hepatozyten-Fettstoffwechsels konnten erste vielversprechende Sekretionen von Triacylglycerol, Lactat und 3-Hydroxybutertat in der 3D-Zellkultur gemessen und mit einer 2D-Zellkultur verglichen werden.
Das Lebersinusoid im vasQchip konnte im Rahmen dieser Dissertation erfolgreich implementiert und evaluiert werden. Die Viabilität-, Aktivität- und Wirkstoffanalysen des etablierten Modells zeigen ein großes Potenzial für eine verbesserte Medikamentenforschung in der präklinischen Phase und ermöglicht eine frühe Identifizierung von potenziell lebertoxischen Medikamenten. Weitere mögliche Anwendungsgebiete sind Krankheitsmodelle, Stammzelltechnologien und 3D-Biodruckverfahren.