Charakterisierung der beiden Phytochrome FphA und FphB aus Aspergillus fumigatus sowie Untersuchungen zu dem intramolekularen Signalmechanismus und der dreidimensionalen Struktur des Phytochroms FphA aus Aspergillus nidulans

Licht wird von vielen verschiedenen Organismen auf unterschiedliche Weise genutzt. Photosynthetisch aktive Organismen nutzen Licht zur Energiegewinnung. Filamentöse Pilze nutzen Licht zur Orientierung und auch um sich auf ändernde Umweltbedingungen vorzubereiten und die Folgen schädlicher Umwelteinflüsse zu kompensieren. Um auf diese Einflüsse möglichst differenziert reagieren zu können, entwickelten sich im Laufe der Evolution eine Vielzahl verschiedener Photorezeptoren, die auf unterschiedliche Wellenlängenbereiche spezialisiert sind. Die Wahrnehmung von rotem und dunkelrotem Licht erfolgt durch die Sensorhistidinkinase Phytochrom. ... mehrFphA (fungal phytochrome A) aus Aspergillus nidulans (AnFphA) ist das am besten untersuchte pilzliche Phytochrom. Das Lichtsignal wird durch Phytochrom in den SakA-Signalweg integriert und führt zur differenziellen Regulation hunderter Gene. Neben der transkriptionellen Regulation vieler Gene über den SakA-spezifischen Transkriptionsfaktor AtfA, reguliert FphA auch die Chromatinstruktur. Während im Genom von A. nidulans lediglich ein Gen für ein Phytochrom kodiert, enthält das Genom seines humanpathogenen Verwandten Aspergillus fumigatus zwei Phytochrom-kodierende Sequenzen, fphA und fphB. A. fumigatus FphA (AfFphA) weist alle Charakteristiken eines kanonischen pilzlichen Phytochroms auf, wenn auch dessen Deletion in A. fumigatus keinen klaren Phänotyp hervorruft. Lichtregulierte Gene und Prozesse, welche durch AnFphA abhängig von Licht oder Temperatur kontrolliert werden, werden ebenfalls durch AfFphA in A. nidulans kontrolliert. Auch die lichtabhängige Aktivierung des SakA-Signalwegs durch AnFphA findet ebenfalls durch AfFphA statt. Ein Unterschied der beiden Phytochrome AnFphA und AfFphA liegt in deren Lokalisation. Während AnFphA hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert ist, konnte AfFphA in A. nidulans ausschließlich in den Zellkernen lokalisiert werden. FphB aus A. fumigatus hingegen besitzt nicht die Fähigkeit Licht oder Temperatur wahrzunehmen. FphB lokalisiert, wie AfFphA, ebenfalls in den Zellkernen und eine Interaktion mit AfFphA konnte nachgewiesen werden. Interessanterweise erfolgt die Aktivierung der SakA-Signalkaskade in Anwesenheit beider Phytochrome aus A. fumigatus sowohl im Licht, als auch im Dunkeln. In einem Galleria mellonella Infektionsmodell führte die Deletion von fphB zu einer gesteigerten Pathogenität. Durch Transkriptom-Analysen wurde gezeigt, dass FphB das nsc-Gencluster reguliert, womöglich gemeinsam mit dem Regulator VeA (velvet A). Das nsc-Gencluster kodiert für NscA-E und den Transkriptionsfaktor NscR, welche an der Produktion von Neosartoricin B beteiligt sind. Neosartoricin B hat eine antiproliferative Wirkung auf T-Zellen und gilt als Immunsuppressivum.
Darüber hinaus wurde die Rolle der Histidinkinase-Domäne von AnFphA in dessen Signalmechanismus adressiert. Nach der Absorption von rotem Licht kommt es zu Änderungen in der Konformation von FphA und zur Aktivierung des C-terminalen regulatorischen Moduls. Mittels Größenausschlusschromatographie wurde der Effekt einer Phosphorylierung von Histidin 770 in der Histidinkinase-Domäne von FphA auf die Konformationsänderung untersucht. Die Phosphorylierung hatte im Vergleich zu der unphosphorylierten Probe eine stärkere Konformationsänderung nach der Absorption von rotem Licht zur Folge. Nach der Absorption von rotem Licht wird zunächst lediglich die Histidinkinase-Domäne exponiert und zugänglich für Phosphorylierungsreaktionen. Erst durch die Phosphorylierung der Histidinkinase-Domäne wird die response regulator Domäne exponiert und zugänglich für nachgelagerte Phosphorylierungsreaktionen. Diese Arbeit liefert neue Erkenntnisse über die Rolle der Histidinkinase-Domäne sowie das erste dreidimensionale Volumenmodell des photosensorischen Moduls von AnFphA, ermittelt durch Kryo-Elektronenmikroskopie.

Light is used by many different organisms in different ways. Photosynthetically active organisms use light to generate energy. Filamentous fungi use light for orientation and also to prepare themselves for changing environmental conditions and to compensate for the consequences of harmful environmental influences. To be able to react to these influences in a most differentiated way possible, many different photoreceptors have developed throughout evolution, which are specialized for different wavelength ranges. The perception of red and far-red light is carried out by the sensor histidine kinase phytochrome. ... mehrFphA (fungal phytochrome A) from Aspergillus nidulans (AnFphA) is probably the best-studied fungal phytochrome. The light signal is integrated by phytochrome into the SakA signaling pathway and leads to the differential regulation of hundreds of genes. In addition to the transcriptional regulation of many genes via the SakA-specific transcription factor AtfA, FphA also regulates chromatin structure. While the genome of A. nidulans encodes only one phytochrome, the genome of its human pathogenic relative Aspergillus fumigatus contains two phytochrome-encoding sequences, fphA and fphB. A. fumigatus FphA (AfFphA) has all the characteristics of a canonical fungal phytochrome, although its deletion in A. fumigatus does not result in a clear phenotype. Light-regulated genes and processes, which are controlled by AnFphA depending on light or temperature, are also controlled by AfFphA in A. nidulans. The light-dependent activation of the SakA signaling pathway by AnFphA also takes place through AfFphA. One difference between the two phytochromes AnFphA and AfFphA lies in their localization. While AnFphA is mainly localized in the cytoplasm, AfFphA in A. nidulans could only be localized in the nuclei. FphB from A. fumigatus, on the other hand, does not have the ability to perceive light or temperature. FphB is also localized in the cell nuclei and an interaction with AfFphA has been demonstrated. Interestingly, activation of the SakA signaling cascade occurs in the presence of both phytochromes from A. fumigatus both in the light and in the dark. Deletion of fphB enhanced the pathogenicity of A. fumigatus in a Galleria mellonella infection model. Transcriptome analysis showed that FphB regulates the nsc gene cluster, possibly together with the regulator VeA (velvet A). The nsc gene cluster encodes NscA-E and the transcription factor NscR, which are involved in the production of neosartoricin B. Neosartoricin B has an antiproliferative effect on T-cells and is considered an immunosuppressive agent.
Furthermore, the role of the histidine kinase domain of AnFphA in its signaling mechanism was addressed. After absorption of red light, changes in the conformation of FphA and activation of the C-terminal regulatory module occur. Size exclusion chromatography was used to investigate the effect of phosphorylation of histidine 770 in the histidine kinase domain of FphA on the conformational change. Compared to the unphosphorylated sample, the phosphorylation resulted in a stronger conformational change after the absorption of red light. Only the histidine kinase domain is initially exposed after absorption of red light and accessible for phosphorylation reactions. Only when the histidine kinase domain is phosphorylated does the response regulator domain become exposed and accessible for downstream phosphorylation reactions. This work provides new insights into the role of the histidine kinase domain as well as the first three-dimensional volume model of the photosensory module of AnFphA, determined by cryo-electron microscopy.