A Priori Approach to Predicting Therapeutic Antibody Behavior in Multimodal Chromatography : Mechanistic and Structure-Based Modeling

Diese Dissertation stellt den ersten wissenschaftlichen Ansatz dar, der eine Verbindung zwischen mechanistischer und strukturbasierter Modellierung für die Prozessentwicklung der multimodalen Chromatographie (MMC) herstellt. MMC ist eine Aufreingungsmethode, welche eine Kombination mehrerer Oberflächenchemien nutzt, um die Qualität und Effizienz der Molekülauftrennung zu verbessern. Die hier vorgestellten Ergebnisse könnten erheblich zu dem routinierten Einsatz von MMC in der biopharmazeutischen Industrie beitragen und die Verwendung von Proteinstrukturwissen in diesem Bereich fördern.
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Monoklonale Antikörper (mAbs), gelten als eine der bedeutendsten Produktklassen von Medikamenten biologischen Ursprungs. Sie haben die Krankheitsbehandlung in therapeutischen Bereichen wie Onkologie und Immunologie revolutioniert. Ein erheblicher Kostenfaktor bei der Herstellung von Antikörpermedikamenten ist die Produktaufreinigung. Daher wurde innerhalb der Entwicklung von biopharmazeutischen Aufreinigungsprozessen (engl. “Downstream Processing“, DSP) bereits bedeutsame Arbeit geleistet, um deren Produktivität zu steigern. Dabei wurden fortgeschrittene Reinigungstechniken wie MMC in den DSP-Methodensatz aufgenommen. Die verbesserte Aufreinigungsleistung von MMC ist besonders von Vorteil für neu entwickelte Antikörperformate, welche spezifische Proteineigenschaften und Verunreinigunsprofile aufzeigen und daher etablierte Techniken und Prozeszabläufe überlasten können. Die erhöhte Komplexität von MMC erfordert jedoch eine produktspezifische Entwicklung dieser Aufreinigungsstufe. Oft müssen zahlreiche Prozessbedingungen untersucht werden, um die Anwendbarkeit von MMC für unterschiedlichste mAb Produkte festzustellen. Dies kann zu einer erheblichen Verlängerung der Entwicklungszeiten und Erhöhung des Ressourcenaufwands führen, was die Implementierung dieser vielversprechenden Technik in die mAb-Aufreinigung verzögert.
Üblicherweise sind für die Entwicklung von MMC-Prozessen kostspielige sowie zeitintensive Vorversuche notwendig, die größere Mengen an Probenmaterial erfordern. Jedoch sind vor allem in den frühen Phasen der Prozessentwicklung sowohl das Probenmaterial als auch die verfügbare Entwicklungszeit stark eingeschränkt. Der wirtschaftliche Erfolg zukünftiger Arzneimittel kann durch eine weitere Reduktion dieser Entwicklungszeiten begünstigt werden. Hieraus folgt ein erklärtes Ziel der biopharmazeutischen DSP, arbeitsintensive Laborexperimente durch den Einsatz von vornherein bekannten Strukturwissen zu ersetzen. Diese Methodik ist unter a priori Prozessentwicklung bekannt. Da das Prozessverhalten durch Oberflächenwechselwirkungen zwischen Antikörpern und deren Aufreinigungsmethoden beinflusst wird, könnte die gezielte Nutzung von Strukturinformationen, Entwicklungszeiten erheblich verkürzen. Frühere Bemühungen, Strukturinformationen mit Hilfe physikalischer Modelle für die MMC-Entwicklung nutzbar zu machen, trafen aufgrund des zugrundeliegenden komplexen Interaktionsmechanismus auf Widerstand. Empirische Modellierungsansätze waren wiederum durch die Menge der verfügbaren Kalibrierungsdaten begrenzt. Die Multiskalenmodellierung könnte ein vielversprechender Ansatz sein, um eine a priori Prozessentwicklung zu verwirklichen, indem molekulare sowie makroskopische Effekte der Adsorptionschromatographie berücksichtigt werden. Der hier gezeigte Ansatz der Multiskalenmodellierung ist eine Zusammenführung von statistischer und mechanistischer Modellierung. Dabei werden mit Hilfe von statistischen Modellen proteinspezifische Adsorptionsparameter aus molekularen Proteineigenschaften vorhergesagt. Diese Adsorptionsparameter werden dann in mechanistischen Chromatographiemodellen genutzt, um makroskopische Chromatographievorhersagen zu ermöglichen.
Diese kumulative Dissertation umfasst drei für sich selbst stehende Publikationen. Sie beschreiben die aufeinander aufbauende Entwicklung eines Multiskalenmodells zur Vorhersage von MMC-Interaktionen. Die Vorhersagen sollten dabei ausschließlich anhand der Aminosäuresequenzen von Antikörper ermöglicht werden. Diese Form der Multiskalenmodellierung ist ein datengetriebener Ansatz, der eine erhebliche Menge an Kalibrierungsmolekülen benötigt, von denen physikochemische Informationen berechnet sowie mechanistische Chromatographiemodelle erstellt werden können. Aus diesem Grund lag der initiale Fokus auf der effizienten Bereitstellung von molekülspezifischen Adsorptionsparametern durch die Generierung von mechanistischen Chromatographiemodellen.
Die erste Veröffentlichung (Kapitel 3) stellt einen standardisierten Arbeitsablauf vor, der die mechanistische Modellierung von MMC für die industrielle Antikörperaufreinigung ermöglicht. Mechanistische Modellierung dient der Simulation von chromatographischen Trennungen als Funktion variierender Prozessparameter. Aufgrund des komplexen Adsorptionsmechanismus der Protein-Liganden-Interaktion stellt die MMC-Modellierung eine anspruchsvolle Aufgabe dar. Bestehende mechanistische Modelle wurden als unpraktikabel erachtet, ob ihrer großen Anzahl an Modellparametern, die vor der Modellanwendung bestimmt werden mussten. Darüber hinaus erhöhte eine ungenaue Parameterkalibrierung, auf Grundlage von wenig-informativen und nicht standardisierten experimentellen Arbeitsabläufen das Risiko unzuverlässiger Modellvorhersagen. Innerhalb von Kapitel 3 wurde die Komplexität eines bestehenden Adsorptionsmodells erheblich reduziert, während die Genauigkeit der Simulation gängiger Prozessbedingungen in einem linearen Adsorptionsbereich beibehalten werden konnte. Darüber hinaus wurde ein standardisierter labor- und computergestützter Arbeitsablauf etabliert, um eine effiziente Kalibrierung und Validierung der thermodynamischen Modellparameter zu ermöglichen. Diese Methodik stellt einen erheblichen Beitrag im Umfeld des DSP dar, indem ein vereinfachter Zugang zu einer modellgestützten MMC-Entwicklung unter niedrigen Beladungsdichten ermöglicht wurde. Darüber hinaus ist der vorgestellte Arbeitsablauf eine Voraussetzung für die effiziente Erfassung von proteinspezifischen Adsorptionsparametern hinsichtlich des finalen Multiskalenmodells.
In der zweiten Veröffentlichung (Kapitel 4) wird eine Methode zur Vorhersage von Antikörperinteraktionen während linearer pH-Gradienten in MMC vorgestellt. Die Feststellung des pH-Retentionspunktes gilt als informatives Vorexperiment für die MMC-Prozessentwicklung. Hieraus kann ein optimaler pH-Bereich bei konstanter Salzkonzentration für darauffolgende Aufreinigungsprozesse abgeleitet werden. Die zugrunde liegende Modellklasse wird als quantitative Struktur-Eigenschafts-Beziehung (engl. quantitative structure-property relationship, QSPR) bezeichnet. Dabei handelt es sich um einen mehrstufigen Prozess, bei dem physikochemische Moleküleigenschaften mit experimentellen Beobachtungen mittels multivariater Regressionsalgorithmen korreliert werden. Im Rahmen von Kapitel 4 wurde die Strukturvorhersage von Antikörpern und die Berechnung physikochemischer Eigenschaften automatisiert, ebenso wie ein experimentelles Hochdurchsatzverfahren und ein fortschrittlicher QSPR-Arbeitsablauf etabliert. Dieser Ansatz ermöglichte die Vorhersage der pH-Retention für verschiedene Antikörper und Antikörperformate anhand ihrer Aminosäuresequenz. Der unmittelbare Nutzen dieses Modells besteht in der strukturbasierten Vorhersage von Prozessbedingungen ohne die Notwendigkeit von vorausgehenden Laborexperimenten. Darüber hinaus könnte das kalibrierte QSPR-Modell als computergestützte Methode verwendet werden, um potenzielle Antikörperkandidaten anhand ihrer Prozesssierbarkeit zu identifizieren, was im Englischen als “Manufacturability Assessment“ bezeichnet wird. Im Hinblick auf das übergeordnete Ziel, eine a priori Prozessentwicklung für MMC zu realisieren, war das Ergebnis dieser Veröffentlichung von zweifachem Nutzen. Erstens wurde eine adaptive Vorlage für die Realisierung von QSPR-Modellen erstellt, die später auf das endgültige Multiskalenmodell übertragen werden konnte. Dies beinhaltet eine automatisierte Strukturvorhersage, Berechnung physikochemischer Eigenschaften, Etablierung von Hochdurchsatzexperimenten sowie eine Modellkalibrierungs- und Validierungsroutine. Zweitens kann der vorhergesagte Prozess-pH Wert als Ausgangspunkt für das endgültige Multiskalenmodell verwendet werden, um eine relevante Prozessvorhersage zu gewährleisten.
Nachdem alle notwendigen Voraussetzungen für die Generierung ausreichender Kalibrierungsdaten erfüllt waren, stellt die dritte und abschließende Veröffentlichung (Kapitel 5) ein Multiskalenmodell zur Vorhersage der Antikörperinteraktion in MMC vor. Im Rahmen dieser Veröffentlichung wurden mechanistische Chromatographie- und statistische QSPR-Modellierung kombiniert. Hierzu wurde ein großer Satz an Antikörperstrukturen und -formaten untersucht. Dieser umfasst 59 volllängen mAbs, fünf unterschiedliche Formate wie IgG1, IgG4 sowie drei voneinander abweichende bi- und tri-spezifische Konstrukte. Von jedem dieser Moleküle wurden antikörperspezifische Eigenschaften berechnet und mechanistische Chromatographiemodelle in verschiedenen pH-Umgebungen kalibriert. Dabei wurden Adsorptionparamter mit Hilfe des neuentwickelte MMC-Modellierungsansatzes aus Kapitel 3 bestimmt. Daraufhin wurden diese Daten verwendet, um ein QSPR-Model, abgeleitet aus Kapitel 4, zu kalibrieren, was die Vorhersage von Adsorptionsparametern aus Antikörperstrukturen ermöglichte. Abschließend wurde die Genauigkeit des Multiskalenansatzes durch die Simulation von MMC-Chromatographie für mehrere Antikörper, Formate und pH-Werte unter niedrigen Beladungsdichten validiert. Dieses Multiskalenmodell ermöglicht die computergestützte Identifizierung von potenziellen MMC-Prozessbedingungen für verschiedenste Antikörperkandidaten. Die gezeigten Ergebnisse veranschaulichen das Potenzial einer a priori Prozessentwicklung in der Antikörperaufreinigung durch die Vorhersage chromatographischen Verhaltens auf Grundlage der Proteinstruktur. Darüber hinaus wurde durch die Untersuchung der strukturellen Antikörpereigenschaften, im Zuge der QSPR-Modellierung, ein Einblick in den multimodalen Adsorptionsprozess gewonnen. Perspektivisch könnten die gewonnen Informationen zur Weiterentwicklung mechanistischer MMC-Modelle führen.
Zusammenfassend leistet diese Dissertation einen erheblichen Beitrag zur beschleunigten Entwicklung von MMC in der biopharmazeutischen Antikörperaufreinigung. Ein standardisierter Arbeitsablauf für die mechanistische MMC-Modellierung wurde eingeführt, um eine modellgestützte Prozessentwicklung zu ermöglichen. Ein QSPR-Modell zur Vorhersage des optimalen Prozess-pH Wertes auf der Grundlage der Aminosäuresequenz wurde etabliert. Diese Methode beschleunigt die Prozessidentifikation und könnte die Auswahl von Antikörperkandidaten durch Berücksichtigung ihrer “Manufacturability“ leiten. Die etablierten Arbeitsabläufe wurden in einem Multiskalenmodell zur Vorhersage des MMC-Verhaltens von Antikörpern kombiniert. Dies ermöglicht ein rein strukturbasiertes und computergestütztes Prozessdesign. Während diese Ergebnisse bereits das Potenzial für eine a priori Prozessentwicklung aufzeigen, könnten die aufgedeckten strukturellen Erkenntnisse zur Weiterentwicklung von Adsorptionsmodellen in der MMC führen. Angesichts der erhöhten Komplexität der MMC-Interaktion im Vergleich zu anderen DSP-Verfahrensschritten könnte diese Dissertation als Vorlage für weitere a priori Prozessmodelle sowie des mechanistischen Verständnisgewinns in verschiedensten Aufreinigungsmethoden dienen.

This dissertation depicts the first study to establish a link between mechanistic and structure-based modeling for the development of multimodal chromatography (MMC) processes. MMC combines different surface chemistries to enhance the quality and efficiency of molecule purification. The research presented herein contributes significantly to the adoption of MMC in the biopharmaceutical industry and promotes the use of structural knowledge in this domain.
Monoclonal antibodies (mAbs), a primary product class of biologically derived medicines, have revolutionized disease treatment in therapeutic areas such as oncology and immunology. ... mehrA significant cost contributor to antibody products is their purification development, known as downstream processing (DSP). Consequently, extensive research has been conducted to enhance the productivity of biopharmaceutical purification. In this context, advanced purification techniques like MMC have been introduced to the DSP toolbox. The improved purification performance of MMC is especially advantageous for novel antibody formats exhibiting specific impurity profiles, which can challenge established purification techniques and processing routines. However, the increased complexity of MMC necessitates a product-specific development for this unit operation. Often, a variety of process conditions need to be explored, to assess the applicability of MMC for a diverse range of mAb products. This can inflate development timelines and resource expenditure, limiting the implementation of this promising technique into mAb purification.
Typically, the development of MMC processes involves costly and time intensive screening experiments requiring substantial amounts of sample material. Particularly in the early stages of process development, sample material as well as development time is scarce. The economic success of launched drug products can be facilitated by further reducing development timelines. Therefore, it has been a long-standing goal of the biopharmaceutical DSP to replace labor-intensive wet lab experimentation by harnessing prior knowledge of molecule structure. This methodology is often referred to as a priori process development. As surface-surface interactions between molecules and purification methods largely affect their process behavior, utilizing structural information could significantly accelerate development timelines. Previous attempts in harnessing structural information for MMC development have struggled to capture the complex mechanism using physics-informed models. Conversely, empirical modeling approaches were limited by the amount of available training data. Multiscale modeling could be a promising path towards achieving a priori process development by considering molecular as well as macroscopic effects of adsorption chromatography. The multiscale modeling approach employed in this thesis merges statistical and mechanistic modeling. Hereto, protein-specific adsorption parameters are predicted from the molecular properties of proteins. These adsorption parameters are then incorporated into mechanistic chromatography models to enable macroscopic chromatography predictions.
This publication-based thesis comprises three independent research articles. These articles detail the sequential development of a multiscale model for predicting MMC interaction based solely on antibody sequence information. This kind of multiscale model is a data-driven approach and requires a substantial amount of training molecules from which physicochemical information can be calculated and mechanistic chromatography models be generated. Accordingly, the initial focus of this thesis was the efficient acquisition of molecule specific adsorption parameters by generation of mechanistic chromatography models.
The first publication (Chapter 3) presents a standardized workflow for mechanistic modeling of MMC in antibody purification at industrially relevant process conditions. Mechanistic modeling enables the simulation of chromatographic operations as a function of varying process parameters. MMC modeling is considered challenging due to the complex adsorption mechanism that needs to be simulated during the multimodal protein-ligand interaction. Previous thermodynamic models were deemed impractical due to the large number of model parameters that needed to be determined prior to model application. Moreover, inaccurate parameter calibration, resulting from uninformative and non-standardized experimental routines, increased the risk of unreliable model predictions. Within Chapter 3, the complexity of an existing adsorption model was substantially reduced while maintaining its accuracy for simulating common process conditions in a linear adsorption regime. Furthermore, a standardized wet lab and in silico workflow was established to enable efficient calibration and validation of the thermodynamic model parameters. This methodology alone represents a substantial contribution in the field of DSP by facilitating straightforward access to model assisted MMC development at low loading density conditions. Additionally, the presented workflow serves as a prerequisite for the final multiscale model to enable the efficient acquisition of protein-specific adsorption parameters.
In the second publication (Chapter 4), a method for predicting antibody retention during linear pH gradients in MMC is introduced. Determining retention pH is considered an informative screening experiment for MMC process development. It can lead to a reliable indication of an optimal range for process pH at a given salt concentration. The underlying model was based on quantitative structure-property relationship (QSPR), which is a multistage process in which physicochemical molecule characteristics are correlated to experimental properties using multivariate regression algorithms. Within Chapter 4, antibody structure prediction and calculation of physicochemical characteristic were automated, alongside the establishment of an experimental high-throughput setup and an elaborate QSPR workflow. This approach enabled the prediction of pH retention for various antibodies and antibody formats using only their amino acid sequence. The immediate benefit of this model includes the structure-based prediction of process conditions without the need for performing wet lab experimentation. Additionally, the calibrated QSPR model could be utilized as an in silico screening tool for identifying antibody candidates suitable for purification at selected process pH. This is often referred to as manufacturability assessment. Regarding the overarching goal of realizing a priori process development in MMC, the outcome of this publication was two-fold. First, an adaptive template for developing QSPR models was established that could later be transferred to the final multiscale model. This includes automated structure prediction, physicochemical characteristic calculation, high-throughput experimentation, as well as a model training and testing routine. Second, the predicted process pH can be utilized as a starting point for the final multiscale model to assure relevant process prediction.
After meeting the necessary prerequisites for gathering sufficient training data, the third and final publication (Chapter 5) introduces a multiscale model for predicting antibody interaction in MMC. Here, mechanistic chromatography and statistical QSPR modeling were combined, and a large quantity of antibody structures and formats investigated. The molecules comprise 59 full-length mAbs, five different formats, including IgG1s, IgG4s, and three different kinds of bi- and trispecific constructs. From each molecule antibody-specific characteristics were calculated and mechanistic chromatography models at various pH environments calibrated. Accordingly, adsorption parameters were determined using the newly developed MMC modeling workflow introduced in Chapter 3. The data was than utilized to train a QSPR model, modified from Chapter 4, to enable the prediction of adsorption parameters from antibody structure. The accuracy of this approach was validated by simulating MMC chromatography for multiple antibodies, formats, and pH values at low loading density conditions. This multiscale model allows in silico screening of potential MMC operating conditions targeting the initial process development of antibody candidates. The results demonstrate the potential of a priori process development in antibody purification by predicting chromatographic behavior based on protein structure. Furthermore, insights into the multimodal adsorption process through investigation of structural contributions of the QSPR parameter models were gained. These insights could yield further developments of mechanistic MMC models.
In conclusion, this dissertation provides a substantial contribution to the accelerated development of MMC in the biopharmaceutical antibody purification across multiple areas. A standardized workflow for mechanistic MMC modeling was introduced to enable a model-assisted process development. A QSPR model for predicting optimal process pH based on the amino acid sequence was established. This tool accelerates process identification and could guide antibody candidate selection by accounting for manufacturability profiles. The established workflows were combined in a multiscale model for predicting antibody behavior in MMC. The model predictions enable an in silico process design requiring only amino acid sequence information. While these results alone demonstrate the potential for a priori process development, the structural correlations could lead to further developments of advanced adsorption models for MMC. Given the exceptional complexity of the MMC interaction compared to other DSP operations, this dissertation could serve as a blueprint for enabling a priori process development and increasing mechanistic understanding throughout different unit operations.