Abstract:
Die Kopplung der HPLC mit einem benchtop NMR wird beschrieben. Dadurch wird ein spektral aufgelöstes Chromatogramm erhalten, das direkten Zugang zu chemischen Informationen ermöglicht. Das Ziel dieser Arbeit ist es, die Sensitivität zu steigern und damit diese Methodik einem breiteren Anwenderspektrum zugänglich zu machen. Dafür ist diese Arbeit in drei Themenbereiche unterteilt.
Zunächst wird die Entwicklung und Optimierung der online und onflow HPLC-NMR Kopplung beschrieben. Zur Kopplung wurde ein $^1$H optimiertes benchtop NMR Spektrometer mit einem B$_0$-Feld von B$_0$ = 1,9 T (entspricht einer $^1$H Larmorfrequenz von 80 MHz) verwendet. ... mehrDie Methode wurde an einem Modellsystem bestehend aus Parabenen (Alkylester der para-Hydroxybenzoesäure) optimiert, wobei die Auftrennung in der liquid adsorption chromatography (LAC) unter isokratischen Bedingungen stattfand. Indem die NMR Aufnahmemethode (Rotationswinkel, Wiederholzeit, Lösungsmittelunterdrückung), die Injektionsparameter sowie die Datenprozessierung optimiert wurden, konnte die Sensitivität um einen Faktor 123 gesteigert werden. Nach vollständiger Optimierung wurde für das Modellsystem die Detektions- (LOD) und Bestimmungsgrenze (LOQ), bezogen auf die injizierte Konzentration, bestimmt. Für das Methoxysignal von Methylparaben betrugen LOD = 0,010 g L$^{-1}$ und LOQ = 0,031 g L$^{-1}$ und für die aromatischen Signale von Pentylparaben LOD = 0,038 g L$^{-1}$ und LOQ = 0,134 g L$^{-1}$ und liegen damit im Bereich publizierter Werte einer online und onflow LAC-500 MHz NMR Kopplung. Mit der optimierten gekoppelten Methodik wurde demonstriert, dass eine binäre Parabenmischung, deren Konzentration einen Faktor 4 unter der erlaubten Höchstmenge in kosmetischen Produkten liegt, mit einer Sensitivität von jeweils SNR $\approx$ 90 analysiert werden konnte. Bei einer Messung chromatographisch überlappender Signalen wurde die spektrale Auflösung verwendet, um die einzelnen Elutionsprofile separat auszuwerten.
Der zweite Themenbereich behandelt die Entwicklung einer chromatographischen Methode mit kontinuierlicher Injektion eines oszillierenden Analytkonzentrationsprofils zur Steigerung der Sensitivität, genannt Fourier-Transformation liquid chromatography (FT-LC). Die FT-LC wurde in der size exclusion chromatography (SEC) mit PS-Standards und UV Detektion etabliert und zusätzlich zur Analyse einer binären Parabenmischung in der LAC-NMR angewandt. Dabei wurde aufgezeigt, dass die Retardierung in der SEC und der LAC unabhängig von der Injektionsmethode und der Anwesenheit eines weiteren Analyten ist. Mit der FT-LC konnte in der SEC mit UV Detektion das SNR pro Quadratwurzel Messzeit um einen Faktor 50 gesteigert werden. In der LAC mit NMR Detektion wurde allerdings nur eine Sensitivitätssteigerung um einen Faktor 1,6 festgestellt. Dieser Faktor fällt geringer aus, da die Sensitivität der LAC-NMR mit konventioneller Injektionsmethode durch die Methodenoptimierung signifikant gesteigert wurde.
Abschließend wird die Entwicklung einer Methode zur Signalunterdrückung in NMR Spektren beschrieben, die unter statischen Bedingungen aufgenommen wurden. Hierfür wurden NMR Spektren einer Analytlösung und des Lösungsmittels, mit dem die Analytlösung hergestellt wurde, abwechselnd in einer Datenmatrix angeordnet. Die Analytsignale wurden aus den Spektren herausgefiltert, indem entlang der Spektrenanordnung eine Fourier-Transformation durchgeführt wurde. Trotz bereits erfolgter Lösungsmittelunterdrückung konnte mit der Fourier-Filterung (FF) die verbleibenden Lösungsmittelsignale um einen weiteren Faktor 18 reduziert werden.
Indem die entwickelten und optimierten Methoden im Detail beschrieben werden, wird ein Transfer auf weitere Anwendungsgebiete und Fragestellungen erleichtert.
Abstract (englisch):
The hyphenation of HPLC to benchtop NMR is described. Due to the NMR detection, a spectrally resolved chromatogram is obtained providing direct access to chemical information. The aim of this thesis is to increase sensitivity and, thus, allowing a wider range of users to benefit from the hyphenated methodology.
This thesis is divided into three subject areas. First, the development and optimization of online and onflow HPLC-NMR hyphenation is described, utilizing an $^1$H optimized benchtop NMR spectrometer with a B$_0$ field of B$_0$ = 1.9 T (corresponding to a $^1$H Larmor frequency of 80 MHz). ... mehrThe method was optimized on a model system of parabens (alkyl esters of para-hydroxybenzoic acid), which were isocratically separated using liquid adsorption chromatography. By optimizing the NMR acquisition method (nutation angle, repetition time, solvent suppression), injection parameters, signal averaging during analyte elution through chromatographic filtering, and manual signal averaging, sensitivity was increased by a factor of 123. After full optimization, the limit of detection (LOD) and the limit of quantification (LOQ) are determined, expressed in terms of the injected analyte concentration. For the methoxy signal of methyl paraben LOD = 0.010 g L$^{-1}$ and LOQ = 0.031 g L$^{-1}$ and for the aromatic signals of pentyl paraben LOD = 0.038 g L$^{-1}$ and LOQ = 0.134 g L$^{-1}$ and are, thus, within the range of published values of an online and onflow LAC-500 MHz NMR hyphenation. Using the optimized hyphenated methodology, a binary paraben mixture with a concentration of a factor 4 below the legal limits in cosmetic products is analyzed with a SNR $\approx$ 90 for each paraben. In a measurement with chromatographically incomplete separation, the spectral resolution is used to resolve the individual elution profiles separately.
The second part of this thesis deals with the development of a chromatographic method with a continuous sample injection with oscillating concentration profile to increase sensitivity, named Fourier transformation liquid chromatography (FT-LC). The FT-LC was developed using size exclusion chromatography (SEC) with polystyrene standards and UV detection. Additionally, it was applied to analyze a binary paraben mixture in LAC-NMR. It is shown that the retardation in SEC and LAC is independent of the injection method and the presence of an additional analyte. In the SEC with UV detection the FT-LC increased the SNR per square root measurement time by a factor of 50 compared to conventional injection. In LAC with NMR detection, however, the application of FT-LC only showed a sensitivity increase by a factor of 1.6. This factor is lower because the sensitivity of the LAC-NMR with conventional injection method was already significantly increased by method optimization.
Finally, the development of a signal suppression method in NMR spectra is described. NMR spectra of an analyte solution and neat solvent, each recorded separately under static conditions, are alternatingly arranged in a data matrix. The analyte signals are filtered out of the spectra by Fourier transformation along the arranged spectra. Although solvent suppression was already applied, the residual solvent signals could be further reduced by a factor of 18 using the Fourier filtering (FF) method.
The methodologies are described in detail to facilitate the transfer of the optimized method to other analyte or separation systems.
