Towards a Mechanistic Understanding of Kinase-Catalysed N-Phosphorylations Using Multiscale Simulations

Phosphorylierungsreaktionen sind zentrale Prozesse in biologischen Systemen. Obwohl seltener als Phosphorylierungen an Sauerstoffatomen, spielen Phosphorylierungen an Stickstoffzentren eine wichtige biologische Rolle. Beispiele hierfür sind die Autophosphorylierung von Histidin in Signaltransduktionskaskaden sowie die reversible Phosphorylierung von Kreatin zu Phosphokreatin, welches als kurzfristig verfügbare Energiereserve dient. Trotz ihrer biologischen Bedeutung sind die molekularen Mechanismen kinasekatalysierter N-Phosphorylierungen bislang nicht vollständig aufgeklärt.
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Hybride QM/MM-Methoden erlauben die Beschreibung enzymatischer Reaktionen mit atomarer Auflösung. Hierzu wird das aktive Zentrum quantenmechanisch (QM) behandelt, während das umgebende Protein klassisch beschrieben wird. Viele biologische Prozesse finden jedoch auf Zeitskalen von Mikro- bis Millisekunden statt, während QM-Simulationen in der Regel auf Nanosekunden beschränkt sind. Daher werden Enhanced-Sampling-Methoden eingesetzt, um die Erkundung der freien Energielandschaft zu verbessern. Semiempirische Methoden wie die Density-Functional-Tight-Binding-Methode (DFTB) bieten zwar die erforderliche Recheneffizienz, liefern jedoch nicht immer die notwendige Genauigkeit.
Zur Verbesserung der Genauigkeit wird eine $\Delta$-Machine-Learning ($\Delta$ML) Korrektur auf Basis hochdimensionaler neuronaler Netzwerkpotenziale (HDNNPs) auf DFTB angewendet. Dadurch kann die Genauigkeit von DFTB in Richtung der Dichtefunktionaltheorie (DFT) erhöht werden, ohne dass die hohe rechnerische Effizienz beeinträchtigt wird. Das $\Delta$ML-Modell wird zunächst im Vakuum mit einem umfangreichen Datensatz von N-Phosphorylierungs-Modellreaktionen trainiert und getestet. Die resultierenden Modelle verbessern die mittels DFTB berechneten Energien und Kräfte signifikant. Anwendungen in QM/MM-Metadynamik-Simulationen zeigen jedoch Herausforderungen bei der Übertragbarkeit zwischen Vakuum und kondensierten Umgebungen, insbesondere im Zusammenhang mit elektrostatischen Wechselwirkungen und der Koordination von Magnesium.
Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurde der Ansatz auf enzymatische Systeme übertragen. Für Histidinkinasen konnte die Übertragbarkeit verbessert werden, indem die vollständige Mg$^{2+}$-Koordinationssphäre in das $\Delta$ML-Modell aufgenommen und die Überpolarisierung an der QM/MM-Grenzfläche reduziert wurde. Enhanced-Sampling-Simulationen lieferten sowohl methodische als auch mechanistische Einblicke in die Autophosphorylierungsreaktion, insbesondere hinsichtlich des Einflusses der Mg$^{2+}$-Koordination und kritischer Simulationsparameter.
Darüber hinaus wurden QM/MM-Metadynamik-Simulationen an einer mitochondrialen Kreatinkinase durchgeführt, um sowohl Konformationsänderungen als auch die katalytischen Schritte des Protonen- und Phosphoryltransfers zu untersuchen. Die Simulationen zeigen die Bedeutung flexibel gewählter kollektiver Variablen und verdeutlichen den Einfluss der elektrostatischen Umgebung auf Reaktionspfad und Produktstabilität. Obwohl die berechneten Barrieren über experimentellen Abschätzungen liegen, liefern die Simulationen qualitative mechanistische Einblicke in den katalytischen Zyklus und identifizieren wichtige Faktoren, die die Reaktionsenergetik beeinflussen.
Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass Multiskalen-Simulationen, welche QM/MM-Methoden, Enhanced Sampling und $\Delta$ML-Korrekturen kombinieren, wertvolle mechanistische Einblicke in kinasekatalysierte N-Phosphorylierungsreaktionen ermöglichen. Gleichzeitig schafft der entwickelte Ansatz eine Grundlage für zukünftige $\Delta$ML-Anwendungen auf große und biologisch relevante enzymatische Systeme.

Phosphorylation reactions are fundamental in biological systems. Although rarer than phosphorylation of oxygen atoms, nitrogen phosphorylations play important biological roles, including histidine autophosphorylation in signal transduction, and reversible phosphorylation of creatine to phosphocreatine, a rapidly mobilisable energy reserve. Despite their relevance, the detailed understanding of the molecular mechanisms of kinase-catalysed N-phosphorylation reactions remains incomplete.
Hybrid QM/MM methods enable the description of enzymatic processes at atomic resolution by employing quantum mechanical (QM) methods for the active site while treating the surrounding protein environment classically. ... mehrHowever, biological processes often occur on micro- to millisecond timescales, whereas QM simulations are typically restricted to the nanosecond regime. Enhanced-sampling techniques are therefore employed to improve the exploration of the free-energy landscape. While semi-empirical methods like density-functional tight-binding (DFTB) provide the necessary computational efficiency, they do not always offer the accuracy needed.
To improve the accuracy of the QM description, a $\Delta$-machine learning ($\Delta$ML) correction based on high-dimensional neural network potentials (HDNNPs) is applied to DFTB, improving its accuracy towards density functional theory (DFT) while retaining the computational efficiency of DFTB. The $\Delta$ML model is trained and evaluated in vacuum for a diverse set of N-phosphorylation model reactions. The resulting models substantially improve the accuracy of DFTB energies and forces. Applications to QM/MM metadynamics simulations reveal transferability challenges between vacuum and condensed environments, particularly for electrostatic interactions and Mg$^{2+}$ coordination.
Building on these observations, the approach was applied to enzymatic systems. For histidine kinase, improved transferability was achieved by including the complete Mg$^{2+}$ coordination sphere in the $\Delta$ML model and by mitigating overpolarisation at the QM/MM interface. Enhanced sampling simulations provided both methodological and mechanistic insight into the autophosphorylation reaction, particularly regarding the influence of Mg$^{2+}$ coordination and artificial restraints.
In addition, QM/MM metadynamics simulations were performed for mitochondrial creatine kinase to investigate conformational loop dynamics and the catalytic steps of proton and phosphoryl transfer. The simulations emphasise the importance of selecting flexible collective variables and highlight the influence of the electrostatic environment on the reaction pathway and product stability. Although the calculated barriers remain higher than experimental estimates, the simulations provide qualitative mechanistic insight into the catalytic cycle and identify important factors that influence the reaction energetics.
Overall, this work demonstrates how multiscale simulations combining QM/MM methods, enhanced sampling, and $\Delta$ML corrections can provide mechanistic insight into kinase-catalysed N-phosphorylation reactions. Furthermore, the presented framework establishes a foundation for future $\Delta$ML applications to large and biologically relevant enzymatic systems.