Abstract:
Angesichts des Klimawandels und einer stetig wachsenden Weltbevölkerung können Mikroalgen eine wichtige Rolle als nachhaltige Energie- und Nahrungsquelle der Zukunft spielen. Zur Extraktion wertvoller Inhalts- und Nährstoffe ist ein Zellaufschluss notwendig. Die Elektroimpulsbehandlung (EIB) bietet eine energieeffiziente und schonende Alternative im Vergleich zu mechanischen Zellaufschlussmethoden. Jedoch sind die biologischen Prozesse und zellulären Mechanismen hinter dem Zelltod nach EIB noch wenig untersucht. Aus diesem Grund wurden die einzellige grüne Mikroalge Chlorella vulgaris und das Cyanobakterium Spirulina als Modellorganismen verwendet, um die Wirkung von EIB auf biologische Zellen zu untersuchen. ... mehrDafür wurde eine Methode zur Überwachung der Viabilität nach EIB unter Verwendung von Fluoresceindiacetat (FDA) in C. vulgaris etabliert. Im Anschluss wurden die experimentellen EIB-Parameter so eingestellt, dass ein fixes Verhältnis von Zellen nach der Behandlung abstirbt, während der andere Teil überlebt. Mit diesen Werkzeugen war eine quantitative Analyse des Zelltodes nach EIB möglich. Basierend auf den Analyseergebnissen wurde die EIB-Extraktion von Proteinen und dem wertvollen blauen Farbstoff Phycocyanin aus Spirulina unter verschiedenen post-EIB Inkubationsbedingungen untersucht.
Zur Optimierung der Elektroextraktionseffizienz in Spirulina wurden die Einflüsse des pH des externen Mediums, der Biomassekonzentration, der Zellaggregation sowie der Energiereduktion untersucht. Das optimierte Elektroextraktionsprotokoll mit höherer Biomassekonzentration und geringerer Behandlungsenergie erfordert eine post-EIB-Inkubation unter kontrollierten Bedingungen (Raumtemperatur, pH 6 oder 8, homogene Suspension), die für die Freisetzung und Stabilität von Phycocyanin entscheidend sind. Mit diesem Wissen besteht eine mögliche biotechnologische Anwendung darin, schonende EIB mit niedrigstem Energieeintrag durchzuführen, was zu einer effizienten Protein- und Phycocyanin-Gewinnung führt.
An C. vulgaris konnte gezeigt werden, dass EIB mit niedrigem Energieeintrag auch als abiotisches Stresssignal wirken kann. Dies wurde sichtbar in Form einer gestörten Redox-Homöostase, bei der sowohl die Freisetzung von Wasserstoffperoxid als auch Lipidoxidation gemessen werden konnten. Die Hemmung von Prozessen, die mit dem programmierten Zelltod (PCD) zusammenhängen, zeigten, dass höchstwahrscheinlich Ca-Signalwege, Aktindynamik und Membranversteifung keine notwendige Rolle beim EIB-induzierten Zelltod spielen. Die Freisetzung von Cytochrom f konnte nur im Hochdruckhomogenisations (HPH) Extrakt und nicht nach EIB nachgewiesen werden. Zellsuspensionen mit hoher Zelldichte, die an der Überlebensschwelle gepulst wurden, zeigten nur eine langsame Manifestation des Zelltods. Dies führte zur Entdeckung eines Zelltod-induzierenden Faktors (CDIF). Es konnte nachgewiesen werden, dass durch EIB und HPH-Behandlung der CDIF aus C. vulgaris extrahiert werden kann. Wasserlöslicher Extrakt, der diesen CDIF enthielt, führte zum Absterben von unbehandelten Mikroalgen (insbesondere nur bei C. vulgaris). Weitere Experimente zeigten die Entstehung des CDIF in der stationären Wachstumsphase, Hitzelabilität und Dosisabhängigkeit. Ebenso wie die Empfindlichkeit gegenüber direkter EIB hing die Empfindlichkeit der Empfängerzellen gegenüber dem CDIF vom Zellzyklusstadium ab. Untersuchungen zur Extraktionseffizienz von Proteinen aus C. vulgaris führten zu dem Ergebnis, dass die erforderliche spezifische Energie für maximalen Ertrag der zuvor bestimmten Behandlungsenergie an der Überlebensschwelle entspricht. Alle experimentellen Ergebnisse weisen darauf hin, dass der EIB-induzierte Zelltod und die damit verbundene hohe Extraktionseffizienz nicht nur auf rein physikalische Phänomene zurückzuführen sind, sondern einen biologischen Prozess beinhalten müssen. Das Arbeitsmodell bezüglich des CDIF beinhaltet, dass der Faktor aus zellwandabbauenden Enzymen wie Chitinasen besteht. EIB bei sehr geringem Energieeintrag wirkt als abiotisches Stresssignal. In Kombination mit einer beschädigten Zellintegrität aufgrund von Poren in der Zellmembran führen PCD-Prozesse zu einer enzymatischen Autolyse, bei der der CDIF (Chitinasen) freigesetzt wird. Die Zellwand wird durch den CDIF geschwächt. Wird der CDIF-haltige Extrakt unbehandelten Empfängerzellen zugesetzt, zeigt er zunächst über den Zellwandabbau eine äußere Wirkung. Nach Internalisierung kann der CDIF als internes Signal fungieren, das PCD auslöst.
Abstract (englisch):
In the face of climate change and a constantly growing world population, microalgae can play a major role as future sustainable energy and food source. For the extraction of valuable components and nutrients, a cell disruption step is necessary. Pulsed electric field (PEF) treatment provides an energy-efficient and gentle alternative compared to mechanical cell disruption methods. However, biological processes and cellular mechanisms behind cell death are still poorly understood. For this purpose, the unicellular green microalgae Chlorella vulgaris and the cyanobacterium Spirulina were used as model organisms to investigate the effect of PEF treatment on a biological cell. ... mehrA method was established to monitor cell viability after PEF treatment in C. vulgaris by using cell sorting based on fluorescein diacetate (FDA). Next, the experimental parameters of PEF treatment were calibrated to a point, where a set ratio of cells undergoes cell death after treatment while the other part stays viable. With these tools in hand, quantitative analysis of the cell death response to PEF treatment was possible. Furthermore, electroextraction of proteins and the valuable blue pigment C-phycocyanin from fresh Spirulina biomass was investigated under the influence of post-PEF incubation conditions.
For optimization of biotechnological electroextraction efficiency in Spirulina, the influences of pH of the external medium, biomass concentration, cell aggregation as well as lower energy input were studied. The optimized electroextraction protocol with higher biomass concentration and lower treatment energy requires post-PEF incubation at controlled conditions (room temperature, pH 6 or 8, homogenous suspension) that are crucial for C-phycocyanin liberation and stability. Taking advantage of this knowledge, a possible biotechnological application consists of administering gentle PEF treatment at the determined lowest specific energy resulting in efficient protein and C-phycocyanin recovery.
It could be shown that PEF treatment of C. vulgaris at lower energy input, while physically inflicting damage, could also act as an abiotic stress signal. This manifests in the form of a perturbed redox homeostasis, where both the release of hydrogen peroxide at the survival threshold as well as lipid oxidation at higher energies could be measured. When inhibiting various programmed cell death (PCD) connected processes, the results showed that most likely calcium signaling, actin remodeling and membrane rigidifying do not play necessary roles in PEF induced cell death. Cytochrome f release could only be verified in high-pressure homogenization (HPH) extract and not at various post-PEF conditions. The fact that high cell density suspensions pulsed at the survival threshold showed only slow manifestation of cell death led to the discovery of a cell-death inducing factor (CDIF). It could be verified that in response to PEF and HPH treatment, a CDIF can be extracted from C. vulgaris. The water-soluble extract containing this CDIF caused recipient microalgae (specifically only C. vulgaris) to die, even though the recipient cells had not been subjected to direct PEF treatment. Further studies showed the generation of the CDIF in the stationary phase, heat-lability, and dose-dependency. Same as sensitivity to direct PEF treatment, the responsiveness of recipient cells to the CDIF depended on the cell cycle stage. When checking protein recovery efficiency in C. vulgaris for varied low energy inputs, the required specific energy for maximum yield was at the previously determined survival threshold. All experimental results point toward the assumption that cell death and extraction efficiency following PEF treatment cannot be a merely physical phenomenon but must involve a biological process. The working model regarding the CDIF proposes that the factor consists of cell wall degrading enzymes such as chitinases. PEF treatment at very low energy input acts as an abiotic stress signal. In combination with damaged cell integrity due to pores in the cell membrane, PCD processes result in enzymatic autolysis releasing the CDIF (chitinases). The cell wall is weakened due to the work of the CDIF. When the water-soluble extract containing CDIF is added to viable recipient cells, it first causes an external effect via cell wall degradation. Secondly, after internalization, the CDIF can act as an internal signal triggering PCD.
