Towards in silico process development and digitized manufacturing for antibody-drug conjugates (ADCs): Mechanistic kinetic modeling and its applications

Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) gehören zu den vielversprechendsten Klassen der Biopharmazeutika und werden zur Behandlung verschiedener Krankheiten, hauptsächlich Krebserkrankungen, eingesetzt. Inspiriert von Paul Ehrlichs Zauberkugel-Konzept sind ADCs, hybride Moleküle, die ein potentes Zytostatikum (den sog. „Wirkstoff“) spezifisch in die Zielzellen transportieren und somit mögliche Off-Target-Effekte minimieren. Seit der Zulassung des ersten ADCs, Mylotarg, im Jahr 2000, hat die Food and Drug Administration der Vereinigten Staaten (FDA) vierzehn weitere ADCs zugelassen und derzeit befinden sich Hunderte weitere ADCs in klinischen Studien. ... mehr
Jedes ADC besteht aus einem monoklonalen Antikörper (mAb) und einem zytotoxischen Wirkstoff, welche über einen Linker kovalent verbunden sind. Hierbei gewährleistet die Antigenspezifität des mAbs, dass ADCs hauptsächlich innerhalb der Zielzellen akkumulieren und dort, meist durch einen chemischen Freisetzungsmechanismus, den Wirkstoff freisetzen. Ein entscheidender Faktor für die therapeutische Wirksamkeit ist das Wirkstoff-zu-Antikörper Verhältnis (DAR), welches typischerweise im Bereich von 2 und 8 liegt. Der DAR-Wert kann durch verschiedene Konjugationstechnologien eingestellt werden, die sich in den Bindungsstellen für die Wirkstoffkonjugation unterscheiden. Dabei unterscheidet man zwischen chemischen (auch stochastisch genannt) und spezifischen Methoden. Bei den stochastischen Methoden werden nativen Bindestellen des mAbs verwendet. Dazu gehören Oberflächen-Lysine oder reduzierte Zwischenketten-Disulfidbrücken, welche ein oder mehrere biochemische Reaktionen erfordern, um die reaktiven Bindestellen für die Konjugation zu erzeugen. Dies führt allerdings zu einem heterogenen ADC-Produkt mit einer breiten Verteilung an DAR-Spezies. Bei den ADCs der neuen Generation wird diese Heterogenität durch sog. spezifische Konjugationstechnologien reduziert, wobei die gewünschten Bindestellen über Antikörper-Engineering integriert werden. Weiterhin erweitern die Entwicklungen neuartiger Wirkstoffe die Möglichkeiten für das ADC-Design, um die therapeutischen Eigenschaften des finalen Arzneimittelprodukts zu verbessern. Diese zunehmende Palette an unterschiedlichen ADCs und beschleunigten Zulassungspfaden, wie z.B. der Breakthrough-Therapie, stellen einzigartige Herausforderungen für Pharmahersteller dar und erfordern eine intensivierte Prozessentwicklung.
Die Herstellungsprozesse von ADCs umfassen mehrere biochemische Reaktionsschritte, wobei zuerst die Bindestellen des mAbs aktiviert werden und danach der Wirkstoff konjugiert werden. Darauf folgen ggf. zusätzliche Aufreinigungsschritte. Ein solcher Bioprozess erfordert eine gut definierte Chemistry, Manufacturing and Control (CMC)-Strategie, um trotz der Variabilität, welche durch zahlreiche Prozessparameter und Rohstoffvariationen beeinflusst wird, immer ein qualitativ hochwertiges Produkt zu erzeugen. In diesem Zusammenhang wurde das Konzept Quality by Design (QbD) von der FDA etabliert, um robuste Herstellungsprozesse basiert auf Prozessverständnis, Risikomanagement und kontinuierlicher Verbesserung zu entwickeln. Ein Kernaspekt hierbei ist das grundlegende Verständnis des Einflusses von kritischen Prozessparametern (CPPs) auf kritische Qualitätsmerkmale (CQAs), welches ebenfalls um Skalierungsfaktoren ergänzt werden kann. Dieses Verständnis ist entscheidend, um den sog. design space festzulegen, in dem Prozessparameter unter Berücksichtigung des Risikos geändert werden dürfen, ohne, dass eine erneute Zulassung erforderlich ist. Relevante CQAs für ADCs sind u.a. der DAR-Wert, die Wirkstoffbeladungsverteilung (DLD) und der Anteil an Aggregaten sowie an freiem Wirkstoff.
In dieser Hinsicht ist die Prozessmodellierung ein effektives Werkzeug zum Verstehen und Gestalten von pharmazeutischen Prozessen und wird auch im aktuellen „Pharma 4.0“ Paradigma gefordert. Prozessmodelle basieren auf mathematischen Gleichungen, die den realen Prozess entweder mithilfe fundamentaler physikalischer Gesetze (mechanistische Modellierung) oder empirischer Korrelationen (statistische Modellierung) darstellen. Letzteres hat in den vergangenen Jahren durch Fortschritte im Bereich Machine Learning an Popularität gewonnen. Diese Methode erfordert jedoch große Datenmengen, die aufgrund der Komplexität und Kostspieligkeit biotechnologischer Experimente schwer zu generieren sind. Im Gegensatz dazu benötigen mechanistische Modelle kleinere Datensätze, ermöglichen Extrapolationen und können mit anderen Modellierungsansätzen verknüpft werden. Die Herausforderung bei der Modelbildung besteht darin, dass notwendige Prozessverständnis zu erlangen, das die Herleitung geeigneter mathematischer Gleichungen ermöglicht. Dies umfasst außerdem einen geeigneten Workflow für die Modellauswahl und dessen Validierung. In Bezug auf ADCs steigt die notwendige Modellkomplexität aufgrund des biologischen Ursprungs und der makromolekularen Struktur des mAb enorm. Das übergeordnete Ziel der Prozessentwicklung ist es, den Einfluss von Prozessparameter auf CQAs wie den DAR-Wert, die Wirkstoffbeladungsverteilung (DLD), den Anteil an Aggregation und die Konzentration des nicht konjugierten Wirkstoffs modelhaft zu beschreiben. Zur Quantifizierung der konjugierten Spezies und Positionsisomere stehen verschiedene analytische Methoden zur Verfügung, wobei am häufigsten Methoden basierend auf Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) und Massenspektrometrie eingesetzt werden.
Ein weiteres Ziel von CMC ist die Entwicklung einer effektiven Überwachungs- und Kontrollstrategie zur Aufrechterhaltung der Prozessrobustheit. Im Einklang mit QbD hat die FDA das Process Analytical Technology (PAT) Konzept etabliert, welches mithilfe neuartiger Sensoren und chemometrischer Modelle die Echtzeit- und Online-Überwachung der CQAs während des Prozesses anstelle von Offline- oder Endprodukt-Messung ermöglicht. Dadurch sollen schlussendlich Echtzeit-Freigaben und, in Kombination mit Prozessmodellen, die Etablierung eines digitalen Zwillings ermöglicht werden.
Speziell in der Prozessentwicklung von ADCs mangelt es an mechanistischen Modellen und PAT-Lösungen, die zur Erfüllung der erwähnten QbD-Anforderungen notwendig sind. Bis dato wurden nur wenige und für besondere Fälle angepasste Prozessmodelle etabliert. Dabei mangelt es vor allem an mechanistischen Modellen, die Reaktionskinetiken parametrisieren und die Konzentration der Spezies über die Zeit beschreiben und dabei möglichst den gesamten Konjugationsprozess abdecken. In einer früheren Doktorarbeit lag der Schwerpunkt auf dem Konjugationsprozess für einen bindestellenspezifischen ADC einschließlich des anschließenden Aufreinigungsschritts. Dabei wurden u.a. Kinetikmodelle und PAT-Sensoren etabliert. Diese Arbeit konnte vielversprechende Ergebnisse und Vorteile für die modellhafte Prozessentwicklung im Falle von bindestellenspezifischen ADCs liefern. Um die Akzeptanz modellbasierter Methoden in der ADC Prozessentwicklung insgesamt zu erhöhen, können offene Herausforderungen und notwendige Folgestudien abgeleitet werden: i) Ausweitung der Kinetikmodelle auf stochastische Konjugationsreaktionen und der vorherigen Reaktionsschritte, ii) Beschreibung des Einflusses verschiedener Wirkstoffe, iii) Beschreibung eines scale-down models und Anwendung der Modell zur Vorhersage von scale-up für die Konjugationsreaktion und iv) ein Algorithmus zur rekursiven Aktualisierung des bestehenden Kinetikmodells mit den online Messungen des neu entwickelten PAT-Sensors für die Konjugationsreaktion.
Das Ziel dieser Doktorarbeit ist es, die ADC-Prozessentwicklung weiter zu digitalisieren, indem Prozessmodelle auf zusätzliche ADC-Reaktionen und -Modalitäten erweitert werden und ihr Nutzen innerhalb modellbasierter Anwendungen gezeigt wird. Der erste Teil der Dissertation konzentriert sich auf die Entwicklung kinetischer Modelle für die primären Reaktionsschritte—Reduktion und Konjugation—im Konjugationsprozess von Cystein-basierten ADCs. Im zweiten Teil untersuchen zwei Studien die Implementierung kinetischer Modelle speziell am Beispiel einer bindestellenspezifischen Konjugationsreaktion: 1) Untersuchung der Vorhersage des Prozess Scale-up und 2) Etablierung eines Soft-Sensors für die erweiterte Echtzeitüberwachung. Diese Arbeit soll daher, neue mechanistische Einblicke durch die Etablierung und Integration von Modellen liefern, um eine robuste Kontrolle des finalen DAR und DLD über verschiedene Skalen hinweg zu erreichen. Neuartige ADC-Modalitäten und reale Wirkstoffe, die sich derzeit in der klinischen Phase befinden, wurden in diese Arbeit einbezogen, was die Relevanz dieser Arbeit unterstreicht.
Im Herstellungsprozess für ADCs ist die Konjugationsreaktion ein entscheidender Prozessschritt, in dem der Wirkstoff an den funktionalisierten mAb konjugiert wird und somit das endgültige therapeutische Produkt entsteht. Hierbei fehlt ein Industrie-relevanter Modellierungsansatz, der leicht auf ähnliche ADCs oder andere Wirkstoffe übertragen werden kann, um so die Anwendbarkeit von Prozessmodellen zu erhöhen. In der vorherigen Doktorarbeit wurde ein neuartiges Kinetikmodell für die homogene Konjugationsreaktion eines Pseudo-Wirkstoffs an die zwei Cysteine eines bindestellenspezifischen ADCs entwickelt. Dieses Model kann jedoch nicht für die stochastische Konjugationreaktion angewendet werden, da z.B. bei der Konjugation an reduzierte Zwischenketten-Cysteine eine weitaus heterogenere Mischung an konjugierter Spezies entsteht. Um das Spektrum der Modelle auf verschiedene ADCs zu erweitern, wurden in der ersten Studie (Kapitel 3) strukturell ähnliche Kinetikmodelle für die Konjugationreaktion von zwei Cysteine-basierender ADCs etabliert: die bindestellenspezifische Konjugation für DAR 2 und die Zwischenketten-Disulfid-Konjugation für DAR 8. Dazu wurden experimentelle Konjugationskinetiken von drei verschiedenen Wirkstoffen und drei verschiedenen mAbs aufgenommen. Umkehrphasen (RP) HPLC wurde als Analytik verwendet, um präzise und vergleichbare Referenzdaten für die beiden verwandten Modalitäten zu erstellen. Die schnelle Konjugationskinetik im Falle von DAR 8 konnte durch langsame, kontrollierte Wirkstoffzufuhr aufgelöst werden. Die Existenz von über- und unterkonjugierten Spezies wurde in den Modellen durch eine anfängliche Cysteine-Verteilung integriert. Die erstellten kinetischen Modelle konnten eine hohe Genauigkeit bezüglich der Referenzdaten für beide Modalitäten erreichen. Dabei konnten sie nachweisen, dass die anfängliche Cysteine-Verteilung maßgeblich den maximal erreichbaren DAR-Wert bestimmt. Der Vergleich von Pseudo- und realen Wirkstoffen ermöglichte den quantitativen Vergleich bezüglich der Konjugationsraten und konnte entscheidende Unterschiede bei der Wirkstoff-Stabilität in Konjugationspuffer nachweisen. Schließlich wurde die Anwendung der Kinetikmodelle für das Prozess-Design und die Optimierung der Reaktionsbedingungen durch ein beispielhaftes in silico-Screening gezeigt.
Die neu gewonnenen Erkenntnisse deuteten darauf hin, dass die vorherige Reduktion den erreichbaren DAR für Zwischen-Ketten Konjugate entscheidend bestimmt. Hierbei fehlt jedoch ebenfalls eine mechanistische Beschreibung der Beziehung zwischen den zahlreichen Reaktionsparametern und den finalen CQAs. Daher wurde in der zweiten Studie (Kapitel 4) die partielle Reduktionsreaktion der acht mAb Zwischenketten-Disulfidbrücken unter variierenden Reduktionsmittel- und mAb-Konzentrationen sowie Reaktionstemperaturen untersucht. Die Reduktionskinetik wurde hier in Form der reduzierten mAb-Fragmente bestimmt, die mittels Kapillargelelektrophorese (CGE) analytisch quantifiziert wurden. Im ersten Schritt wurden verschiedene Kinetikmodelle mit unterschiedlichen Reaktionsnetzwerken und Parametersätzen erstellt und danach das beste Modell anhand von Fehlermetriken und statistischen Kriterien ausgewählt. Ein zentrales Ergebnis war, dass die reduzierten Disulfide nach der Reduktion wieder oxidieren können, wobei dieses Phänomen ausschließlich zwischen den Disulfiden der schweren und leichten Ketten auftritt. Im zweiten Schritt wurden multiple lineare Regressionsmodelle (MLR) erstellt, die anhand der Konzentration an jedem Zeitpunkt der Reduktion das finale Konjugationsergebnis vorhersagen. Dieses beinhaltet den DAR und die DLD, welche durch RP-HPLC bestimmt wurden. Zusammen bildeten die Reduktionskinetik- und Regressionsmodelle ein integriertes Kinetikmodell, welches ein neuartiges Werkzeug darstellt, um den Einfluss der Reaktionsbedingungen in der Reduktion auf das finale Konjugationsergebnisse in silico zu analysieren. Eine Fallstudie konnte die Fähigkeit dieses Ansatzes zur Auswahl geeigneter Reaktionsparameter, um die DLD bei konstantem DAR-Wert fein zu justieren, aufzeigen.
Beim Eintritt in spätere klinische Phasen oder bei der Zulassung werden Scale-up- oder Vergleichbarkeitsstudien durchgeführt, um die großtechnischen Prozessparameter zu definieren und robuste ADC-Prozesse zu etablieren. Dies basiert hauptsächlich auf einer vergleichenden Analyse der endgültigen CQAs zwischen dem im Reaktionsscreening etablierten Prozess und dem großtechnischen Prozess. Diese Studien sind jedoch ressourcenintensiv, berücksichtigen nicht die Reaktionskinetik und liefern nicht das von QbD geforderte Verständnis des Parameter-Einflusses in verschiedenen Skalen. Um die Möglichkeit modellbasierter Ansätze zur Abschätzung der Skalierbarkeit der Konjugationsreaktion zu untersuchen, wurde in der dritten Studie (Kapitel 5) ein bestehendes Kinetikmodell mit numerischer Strömungssimulation (CFD) gekoppelt. Dies bildete ein sog. 3D-Reaktormodell, welche für drei häufig verwendete Reaktoren unterschiedlicher Volumina in der ADC-Herstellung erstellt wurde. Anschließend konnte der Effekt der Reaktorgröße und großtechnischer Mischparameter auf die Konjugationsdynamik in silico analysiert werden. Aufgrund der konsekutiven Natur und der Bindestellenspezifität dieser Reaktion wurden der endgültige DAR-Wert und die Homogenität nicht bemerkenswert durch die untersuchten Parameter-Variationen oder die Reaktorgeometrie beeinflusst. Da der Einfluss des Mischens auf den DAR-Wert in kleineren Reaktionsgefäßen, welche für die anfängliche Prozessentwicklung verwendet werden, ebenfalls unbekannt ist, wurden experimentelle kinetische Studien genutzt, um die Bedeutung der anfänglichen Vermischung sowie der Mischgeräte für die Konsistenz des DAR zu demonstrieren. Insgesamt zeigten sowohl die experimentellen Studien im Kleinmaßstab als auch die Simulationen im großtechnischen Maßstab, dass eine adäquate Durchmischung besonders in kleineren Reaktionsgefäßen eher schwierig zu erreichen ist, während dies in größeren Maßstäben aufgrund des Verhältnisses von Zuführungs- und Mischzeiten normalerweise unproblematisch ist. Eine Analyse der Zeitskalen wurde zusätzlich als Alternative vorgeschlagen, um den potenziellen Einfluss von Mischzeiten auf die Reaktionskinetik abzuschätzen.
Bei der Konjugationsreaktion wird das konjugierte Endprodukt normalerweise nach der Reaktion durch eine Probenahme offline analysiert. Dies liefert keinerlei Prozessinformationen, die es ermöglichen, den Prozess bei Bedarf anzupassen. Ursächlich hierfür ist der Mangel an verfügbaren Sensoren, die die konjugierenden Spezies während der Reaktion überwachen. Obwohl der zuvor entwickelte PAT-Sensor Echtzeitmessungen des DARs liefert, kann dieser nicht direkt verwendet werden, um die einzelnen reagierenden Spezies im bestehenden Kinetikmodell zu aktualisieren. Darüber hinaus unterliegen sowohl Sensor- als auch Modellvorhersagen Unsicherheiten und müssten daher kombiniert werden, um eine präzisere Vorhersage der aktuellen Reaktionsfortschrittes zu liefern. In der vierten Studie (Kapitel 6), wird die Erstellung eines unsicherheitsbewussten Soft-Sensors für die Konjugationsreaktion beschrieben, welcher durch die Fusion von spektroskopischen Sensorvorhersagen mit einem Kinetikmodell mithilfe eines Extended Kalman-Filters (EKF) erreicht wurde. Die Kombination von Sensor und Kinetikmodell durch den EKF-Algorithmus ermöglichte die rekursive Aktualisierung der einzelnen reagierenden ADC-Spezies, obgleich der Sensor lediglich den DAR-Wert bestimmen kann. Ein Gauß-Prozess Regression (GPR) Modell wurde zusätzlich verwendet, um die notwendigen Unsicherheitsschätzungen für die Sensorvorhersagen liefern zu können. Es konnte gezeigt werden, dass der EKF sorgfältig getunt werden muss, damit dieser die zeitabhängige Modell- und Sensorunsicherheit berücksichtigt und den Fehler im Vergleich zum unkorrigierten Kinetikmodell reduziert. Schließlich erwies sich das entwickelte Framework als robust gegenüber Sensorrauschen sowie fehlerhaften Modellinitialisierungen und wurde erfolgreich vom Batch- auf den Fed-Batch-Modus übertragen.
Zusammenfassend erweitert diese Dissertation das Modell-Repertoire für die modellbasierte ADC-Prozessentwicklung und Prozessdigitalisierung mithilfe von vielfältigen Reaktionsmodellen und innovativen modellbasierten Ansätzen. Insbesondere konnten die erstellten Kinetikmodelle zum einen zur Verbesserung des notwendigen Prozessverständnisses über mehrere Reaktionsschritte hinweg beitragen und zum anderen ihr Potential für die in silico Optimierung der Reaktionsbedingungen aufzeigen. Durch die Kopplung eines Modells mit CFD konnte außerdem neue Erkenntnisse in die dominierenden Faktoren hinsichtlich Scale-up gewonnen werden. Weiterhin wurde ein neuartiges Soft-Sensor Konzept etabliert, welches zur erweiterten und robusten Prozessüberwachung der Konjugation genutzt werden kann. Insgesamt ebnen diese Errungenschaften den Weg für eine wissensgetriebene und effizientere ADC-Prozessentwicklung sowie robustere Herstellungsprozesse.

Antibody-drug conjugates (ADCs) are one of the most promising classes of biopharmaceuticals and are used for the treatment of various diseases, primarily for cancer indications. Inspired by Paul Ehrlich’s “magic bullet” concept, ADCs are hybrid molecules that transport a potent cytotoxic payload (“drug”) specifically to target cells, thus minimizing potential off-target effects. Since the approval of the first ADC, Mylotarg, in 2000, the U.S. Food and Drug Administration (FDA) has approved fourteen ADCs and hundreds more are currently proceeding in clinical trials.
Each ADC consists of a monoclonal antibody (mAb) and a cytotoxic drug covalently connected via a chemical linker. ... mehrThe antigen specificity of the mAb ensures that the ADC primarily accumulates inside the target cells, where it releases its payload often triggered through a chemical release mechanism. Crucial for the therapeutic efficacy is the Drug-to-Antibody Ratio (DAR), which typically ranges from 2 to 8. The DAR can be controlled through various conjugation methods, which differ in the binding sites for payload attachment. These methods can be divided into stochastic and site-directed conjugation methods. Regarding the former, the native binding sites on the mAb are utilized, such as surface lysine residues or reduced interchain disulfide bonds. This requires one or a few biochemical reactions to generate reactive bindings sites. The resulting conjugated ADC product usually exhibits a wide distribution of different DAR species. Recently, next-generation ADCs effectively reduced this heterogeneity by using site-specific conjugation technologies. Additionally, novel payloads are expanding the array of options for ADCs design aiming to improve the overall therapeutic properties of the final drug product. This evolving landscape and accelerated approval paths, like Breakthrough Therapy designation, presents unique challenges for pharmaceutical companies and requires an intensified process development.
Manufacturing of ADCs involves several biochemical reaction steps, namely mAb functionalization and conjugation, followed by additional purification steps. Such a bioprocess requires a well-defined Chemistry, Manufacturing and Control (CMC) strategy to consistently generate a high-quality product despite the variability introduced by numerous process parameters and raw materials variations. In this context, Quality by Design (QbD) is a systematic approach proposed by the FDA to develop robust manufacturing processes and is based on process understanding, risk management, and continuous improvement. A key aspect of QbD is gaining insights into the relationship between critical process parameters (CPPs) and critical quality attributes (CQAs), which may also include scaling factors. This understanding is essentially needed to define the design space, in which process parameters can be changed aware of the risk without the need for re-approval.
In this regard, process modeling is a powerful tool for understanding and designing pharmaceutical processes and is also pushed within the current Pharma 4.0 paradigm. Process models are based on mathematical equations trying to represent the real process using either fundamental physical laws, called mechanistic modeling, or empirical correlations, called statistical modeling. While the latter has recently gained popularity through major advances in Machine Learning, it requires large amounts of data, which are challenging to generate due to the complex, cost-intensive nature of biotechnological experiments. In contrast, mechanistic models need smaller datasets for calibration, allow for extrapolation and can integrate with other modeling approaches. Herein, the main challenge is to obtain the necessary process understanding which allows for the postulation of suitable mathematical expressions. This also involves a suitable workflow for model selection and validation. For ADCs, the necessary complexity for model building increases due to the biological origin and macromolecular structure of the mAb. The primary goal for process development is to describe the influence of process parameters on the CQAs, such as the DAR, the Drug Load Distribution (DLD), the level of aggregates and of unconjugated drug. To resolve conjugated species and positional isomers, different analytical methods are available. Most commonly, methods based on High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) and mass spectrometry are utilized.
Another major CMC task is establishing an effective monitoring and control strategy for maintaining process robustness. In agreement with QbD, the FDA introduced the Process Analytical Technology (PAT) concept, which promotes advanced sensor technologies in combination with chemometric modeling allowing for real-time, on-line monitoring of CQAs during the process, rather than traditional off-line and end-product testing. This ultimately aims to pave the way for real-time release and, in combination with process models, the establishment of a digital twin.
In the field of ADCs, the fulfillment of the mentioned QbD demands is still hindered due to a significant gap in model and PAT tools utilization. Only a few model-based approaches for individual cases have been recently established. Shortcomings remain in reliable mechanistic models that parametrize reaction kinetics and describe the concentration of species over time, also covering the entire conjugation process. In a prior PhD thesis, the focus has been on the conjugation process for site-directed ADCs including the subsequent purification step, employing a conjugation kinetic model and a PAT sensor among other things. These studies showed promising results and benefits for process development in the case of site-directed ADCs. To increase the acceptance of model-based methods in ADC process development, open challenges and tasks can be derived: i) extension of kinetic models towards stochastic conjugation reactions including the previous reaction steps, ii) description of the effect of different payloads, iii) investigation and model-based prediction of the influence of mixing, scale, and vessel geometry for the conjugation reaction, and iv) an algorithm to recursively update the conjugation kinetic model with the newly established sensor predictions.
The objective of this thesis was to further digitalize ADC process development by expanding process models to a wider range of ADC reactions and modalities, as well as to demonstrate their benefit within model-based applications. The first thesis part focuses on the development of kinetic models for the primary reaction steps—reduction and conjugation—in the conjugation process of cysteine-based ADCs. In the second part, two case studies deal with the implementation of kinetic models specifically for the site-directed conjugation reaction: 1) studying the prediction of process scale-up and 2) establishing a soft-sensor for advanced real-time monitoring. Thus, this work aimed to gain mechanistic insights through the establishment and integration of models in order to achieve robust control of the final DAR and DLD throughout different scales. Novel ADC modalities and real payloads, which are currently in the clinical phase, were included in this work, underscoring the relevance of this work.
The conjugation reaction is a key step in the ADC process, as the payload is conjugated to the functionalized mAb forming the final therapeutic product. Here, an industry-applicable modeling approach, that can be easily transferred to similar ADCs and payloads to increase the acceptance of process models, is currently missing. In the former work, a novel kinetic model for the homogeneous conjugation reaction of a surrogate payload to the engineered cysteines of a site-directed ADC has been developed. However, this model cannot be transferred to stochastic conjugation reactions, as, e.g., the conjugation to reduced interchain disulfides produces a more heterogeneous mixture of conjugated species. To widen the spectrum of models in ADC conjugation reactions, in the first study (Chapter 3) structurally similar kinetic models were established for the conjugation of two cysteine-based ADCs, namely site-directed conjugation for DAR 2 and interchain disulfides conjugation for DAR 8. The experimental data of three different payloads and three different mAbs were included. Reversed-phase (RP) HPLC as analytics provided accurate and comparable reference data across the two related modalities. Particularly for DAR 8, the fast conjugation trajectories could be resolved using slow, controlled drug feeding. The presence of over- and under-conjugated species was incorporated in the models via an initial cysteine distribution. The kinetic models showed good accuracy with regards to the reference data for both modalities, whereas they also highlighted that primarily the reactive, initial cysteine distribution controls the maximum achievable DAR value. Comparing surrogate and real payloads enabled to quantify variations in conjugation rates and revealed large differences in payload stability in conjugation buffer. Finally, the kinetic model’s ability to aid in process design and optimize reaction conditions was showcased through an exemplary in silico screening.
The newly gained kinetic insights suggested that the previous reduction strongly affects the achievable DAR for interchain disulfide conjugates. However, this reaction lacks a mechanistic description of the relationship between the numerous reaction parameters and the final CQAs. Therefore, in the second study (Chapter 4), the reduction reaction of the eight mAb interchain disulfide bonds under varying reducing agent concentrations, mAb concentrations, and reaction temperatures was investigated. The reduction kinetics were herein determined in terms of the reduced mAb fragments as quantified by Capillary Gel Electrophoresis (CGE). First, various reduction kinetic models containing different reaction networks and parameter sets were formulated and the overall best model was selected using error metrics and statistical criteria. A key finding was that the reduced disulfides can undergo re-oxidation after being reduced, while this phenomenon appeared to occur exclusively between the disulfides connecting heavy and light chains. Second, multiple linear regression (MLR) models were established which used the concentrations of the reduction species at each reduction time point to predict the final conjugation outcome, namely the DAR and DLD as determined by RP-HPLC. Together, the reduction kinetic and regression models formed an integrated kinetic model which created a novel tool for in silico analysis of the reduction reaction conditions while directly estimating the influence on the final conjugation results. A case study emphasized the capability of the model in selecting reaction parameters to finely adjust the final DLD even for constant DAR value.
Upon entering later clinical phases or approval, scale-up or comparability studies are performed to define the large-scale process parameters in order to establish robust ADC processes. These are mainly based on side-by-side analysis of the final CQAs between the process established at the reaction screening and the large-scale process. However, these studies are resource-intensive, do not account for the reaction kinetics or provide the QbD-demanded understanding of the parameter influence at different scales. To evaluate the capability of model-based approaches for assessing conjugation reaction scalability, in the third study (Chapter 5) the integration of a kinetic model into computational fluid dynamics (CFD) was investigated. This led to a 3D-reactor model which was generated for three commonly used reaction vessels of varying scales in ADC manufacturing. Subsequently, the effect of the reactor scale and large-scale mixing parameters on the conjugation dynamic could be analyzed in silico. Due to the consecutive nature and the site-selectivity of this reaction, the final DAR value and homogeneity were not remarkably influenced by the studied parameter variations or reactor geometry. As the importance of mixing for the DAR value in small-scale devices, which are used during initial process development, is also unknown, experimental kinetic studies were utilized to demonstrate the importance of proper initial homogenization and mixing devices for DAR consistency. Overall, both experimental small-scale studies and large-scale simulations demonstrated that adequate mixing is rather difficult to achieve at small scales, whereas at larger scales this is usually unproblematic due to the ratio of feeding and mixing times. A time-scale analysis was proposed as an alternative to estimate the potential impact of mixing times on the reaction kinetics.
In the conjugation reaction, the conjugated end product is usually sampled and analyzed offline, which does not provide process information allowing to adjust the process, if necessary. This is mainly due to the lack of available sensors able to monitor the conjugating species. Although the formerly developed Ultraviolet/Visible (UV/Vis)-based PAT sensor provides real-time measurements of the DAR, it cannot be used to update the single reacting species in the existing kinetic models. Additionally, both sensor and model predictions are subject to uncertainty and should be therefore combined to provide more accurate estimations of the current reaction than the individual models. In the fourth study (Chapter 6) the creation of an uncertainty-aware soft-sensor for the conjugation reaction is described, which fuses spectroscopic sensor predictions with a kinetic model using an Extended Kalman Filter (EKF). The combination of both sensor and kinetic model by the EKF algorithm enabled the update of the single reacting ADC species recursively, despite the sensor only measuring the DAR value. A newly applied Gaussian Process Regression (GPR) model was used to provide the necessary uncertainty estimates along with the sensor predictions. It was shown that the EKF must be carefully tuned so that it accounts for the time-varying model and sensor uncertainty while reducing the error compared to the uncorrected kinetic model. Finally, the developed framework proved to maintain robustness against sensor noise as well as faulty model initializations and was successfully transferred from batch to fed-batch mode.
In conclusion, this work advances the computational toolbox for model-based ADC process development and process digitalization through diverse reaction models and innovative model-based approaches. The established kinetic models particularly contributed to improving the process understanding spanning over multiple reaction steps as well as in showcasing their potential for in silico optimization of reaction conditions. Through the coupling of a kinetic model and CFD, novel insights into the dominating factors for scale-up could be derived. Further, a novel soft-sensor framework showed its capabilities for advanced and robust real-time monitoring of the conjugation reaction. Overall, the achievements of this thesis paved the way for more knowledge-driven and efficient ADC process development as well as more robust manufacturing processes.