Protein Monitoring and Interpretation of Spectroscopic Signals using Data-Driven and Physically Informed Modeling

Die Herstellung biopharmazeutischer Proteine unterscheidet sich grundlegend von der Synthese
niedermolekularer Wirkstoffe, da die makromolekulare Struktur und die damit verbundenen höheren
Strukturebenen eine entscheidende Rolle für die therapeutische Wirksamkeit und Sicherheit spielen.
In diesem Kontext ist die Produktqualität keine statische Eigenschaft, sondern eine dynamische
Variable, die kontinuierlich auf die physikochemischen Einflüsse der Prozessumgebung reagiert.
Ein kritischer Indikator für prozessbedingten Stress ist die Proteinaggregation, die nicht nur die
... mehr
Ausbeute mindert, sondern auch erhebliche immunogene Risiken birgt. Unter realen Bedingungen
des Downstream-Processings (DSP) tritt die Aggregatbildung jedoch selten als isoliertes Phänomen
auf; vielmehr ist sie eng mit Konformationsänderungen, variierenden Proteinkonzentrationen und
Modifikationen der umgebenden Puffermatrix verknüpft. Diese molekulare Komplexität stellt eine
doppelte Herausforderung für die Prozessanalytik dar: Einerseits müssen strukturelle Veränderungen
in Echtzeit erfasst werden, andererseits überlagern sich die spektralen Signaturen der verschiedenen
Komponenten im Prozessstrom, was die direkte mathematische Isolierung erschwert.
Während klassische Offline-Referenzmethoden präzise quantitative Daten liefern, ist ihre Eignung für
eine proaktive Prozesskontrolle durch eine inhärente Zeitverzögerung und den Aufwand der Probenahme
begrenzt. Inline- und Online-Spektroskopiesensoren, insbesondere die Raman-Spektroskopie,
bieten einen hochauflösenden Zugang zu strukturellen Proteinmerkmalen direkt im Prozessstrom.
Folglich verschiebt sich die technologische Herausforderung von der physikalischen Messung selbst
hin zur mathematischen Dekonvolution komplexer, überlagerter Spektren. Zur Bewältigung dieser
Aufgabe existieren verschiedene Modellierungsansätze, die im Rahmen dieser Arbeit systematisch
untersucht und verglichen wurden. Lineare chemometrische Methoden, allen voran die Partial-Least-
Squares-Regression (PLS), gelten als robuster und weit verbreiteter Industriestandard, sofern die
Kalibrierungs- und nachfolgenden Anwendungsbedingungen eng aufeinander abgestimmt sind. Im
Gegensatz dazu versprechen nichtlineare, rein datengetriebene Ansätze wie Convolutional Neural
Networks (CNNs) eine flexiblere Beschreibung hochkomplexer, nichtlinearer Zusammenhänge
innerhalb spektraler Daten; sie erfordern jedoch typischerweise umfangreiche Datensätze und
verringern aufgrund ihrer inhärenten Komplexität die mathematische Transparenz. Ein grundlegend
komplementärer Weg wird durch physikalisch informierte Hard-Modeling-Methoden beschritten, die
explizite Annahmen über Peakformen und Signalzusammensetzungen nutzen, um überlagerte Banden
aufzulösen, und somit eine direkte mechanistische Interpretierbarkeit spektraler Veränderungen
bieten. Vor diesem Hintergrund widmet sich die vorliegende Arbeit der gezielten Weiterentwicklung
spektroskopischer PAT-Strategien (Process Analytical Technology) durch die Kombination von
Raman-Messungen mit diesen komplementären Modellierungsansätzen unter realistischen DSPBedingungen.
Die Methodik dieser Arbeit gliedert sich in drei aufeinanderfolgende Phasen, die den Übergang
von einer rein quantitativen Konzentrationsüberwachung zur mechanistischen Strukturaufklärung
beschreiben, wobei Kapitel 3 den Ausgangspunkt bildet. Um den mit spektroskopischen Modellen
typischerweise verbundenen hohen Kalibrieraufwand zu minimieren, wurde ein automatisiertes
Probenahme- und Messsystem entwickelt. Durch die Kopplung eines Flüssigkeitschromatographie-Systems
inklusive Autosampler mit einem Raman-Spektrometer konnten repräsentative synthetische
Mischungen aus Lysozym und variierenden Phosphat- sowie Citratpuffersystemen automatisiert
generiert und gemessen werden. Die auf diesem Datensatz trainierten Partial-Least-Squares-Modelle
wurden erfolgreich auf einen dynamischen Ultrafiltrations-/Diafiltrationsprozess (UF/DF) übertragen,
was die Inline-Echtzeitüberwachung von Protein- und Pufferkonzentrationen ermöglichte.
Folglich lieferte dieses Kapitel den technischen Machbarkeitsnachweis für eine geschlossene Analysestrategie,
die von der automatisierten Datenerfassung bis zur prozessnahen Anwendung reicht.
Auf diesen Grundlagen aufbauend befasst sich Kapitel 4 mit der selektiven Differenzierung und
Quantifizierung von nativen Proteinen und deren Aggregaten in einer chromatographischen Umgebung.
Unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) als Modellsystem wurden kontrollierte
thermische Stressstudien und statistisch geplante Mischungsreihen durchgeführt, um vom Proteingehalt
unabhängige spektrale Marker für den Aggregationszustand zu identifizieren. Diese Modelle
wurden anschließend in dynamischen Bind-and-Elute-Anionenaustauschchromatographie-Läufen
(AEX) validiert. Ein direkter Vergleich zwischen linearen PLS-Modellen und nichtlinearen CNNArchitekturen
zeigte, dass eine hohe Vorhersageleistung innerhalb kontrollierter Trainingsdaten
nicht zwangsläufig mit der Robustheit gegenüber realen Prozessfluktuationen korreliert. Das Kapitel
demonstriert, dass datengetriebene Ansätze eine zuverlässige Echtzeit-Vorhersage von Monomerund
Aggregatprofilen in der präparativen Chromatographie ermöglichen, unterstreicht jedoch gleichzeitig
die Notwendigkeit einer sorgfältigen Modellauswahl im Hinblick auf Datenverfügbarkeit und
Transferierbarkeit.
Um die verbleibende Lücke zwischen rein prädiktiven Modellen und physikalischem Prozessverständnis
zu schließen, wurde in Kapitel 5 ein komplementärer Hard-Modeling-Ansatz etabliert. Der
Fokus wurde auf die Amid-I-Region der Raman-Spektren gelegt, die hochsensitiv gegenüber
Sekundärstrukturveränderungen ist, jedoch gleichzeitig durch salzinduzierte Hintergrunddrifts während
chromatographischer Elutionen stark gestört wird. Es wurde ein restringiertes Pseudo-Voigt-Modell
entwickelt, das ein integriertes Hintergrundmodell nutzt, um salzabhängige Einflüsse mathematisch
von proteinspezifischen Signalbeiträgen zu trennen. Die resultierenden modellbasierten mathematischen
Deskriptoren, wie die Verschiebung des Linienschwerpunkts der Amid-I-Bande, wurden
erfolgreich gegen quantitative Offline-Referenzdaten für Monomere und Aggregate validiert. Dieser
Ansatz veranschaulicht, dass das Hard-Modeling eine mechanistische Lücke schließt, indem es
physikalisch interpretierbare Strukturmerkmale direkt aus dem active Prozess liefert, ohne sich
ausschließlich auf korrelative Muster zu verlassen.
In ihrer Gesamtheit verknüpft diese Dissertation somit drei komplementäre Ebenen der modernen
Prozessanalytik: Eine automatisierte, reproduzierbare Datengenerierung (Kapitel 3), die robuste,
datengetriebene Vorhersage kritischer Qualitätsattribute unter realistischen Prozessbedingungen
(Kapitel 4) und die physikalisch informierte Auflösung komplexer Spektralsignale zur mechanistischen
Strukturinterpretation (Kapitel 5). Die Arbeit zeigt, dass Raman-basierte Prozessanalytik für
therapeutische Proteine weit über die bloße Optimierung der Vorhersagegenauigkeit hinausgehen
muss. Erst das gezielte Zusammenspiel aus Prozesswissen, maßgeschneiderter Vorverarbeitung und
der bewussten Abwägung des Trade-offs zwischen datengetriebener Flexibilität und physikalischer
Transparenz ermöglicht ein tieferes Prozessverständnis. Folglich leistet diese Arbeit einen wesentlichen
Beitrag zur Implementierung intelligenter, interpretierbarer und robuster PAT-Strategien im
biopharmazeutischen Downstream-Processing.

The manufacturing of biopharmaceutical proteins differs fundamentally from the synthesis of
smallmolecule drugs, as the macromolecular structure and its associated higher-order structural levels
play a decisive role in therapeutic efficacy and safety. Within this context, product quality is not a
static property but rather a dynamic variable that continuously responds to the physicochemical
influences of the processing environment. A critical indicator of process-induced stress is protein
aggregation, which not only reduces yield but also poses significant immunogenic risks. ... mehrUnder
real-world downstream processing (DSP) conditions, however, aggregate formation rarely occurs as
an isolated phenomenon; rather, it is intimately linked to conformational changes, varying protein
concentrations, and modifications of the surrounding buffer matrix. This molecular complexity
presents a dual challenge for process analytics: on the one hand, structural alterations must be
captured in real time, while on the other, the spectral signatures of the various components within
the process stream overlap, thereby complicating direct mathematical isolation.
While classical offline reference methods provide precise quantitative data, their suitability for
proactive process control is limited by an inherent time delay and the burden of sampling. Inline
and online spectroscopic sensors, particularly Raman spectroscopy, offer high-resolution access to
structural protein features directly within the process stream. Consequently, the technological
challenge shifts from the physical measurement itself toward the mathematical deconvolution of
complex, superimposed spectra. To address this task, different modeling approaches exist, which were
systematically investigated and compared within the framework of this work. Linear chemometric
methods, most notably partial least squares (PLS) regression, are considered a robust and widely
established industry standard, provided that calibration and subsequent application conditions are
tightly aligned. In contrast, non-linear, purely data-driven approaches such as convolutional neural
networks (CNNs) promise a more flexible description of highly complex, non-linear relationships
within spectral data; however, they typically require extensive datasets and reduce mathematical
transparency due to their inherent complexity. A fundamentally complementary path is pursued
by physically informed hard-modeling methods, which utilize explicit assumptions regarding peak
shapes and signal composition to resolve overlapping bands, thereby offering direct mechanistic
interpretability of spectral alterations. Against this background, the present work is dedicated
to the targeted advancement of spectroscopic PAT (Process Analytical Technology) strategies by
combining Raman measurements with these complementary modeling approaches under realistic
DSP conditions.
The methodology of this thesis is structured into three consecutive phases that describe the
transition from purely quantitative concentration monitoring to mechanistic structural elucidation,
with chapter 3 forming the initial starting point. To minimize the high calibration effort typically
associated with spectroscopic models, an automated sampling and measurement setup was developed.
By coupling a liquid chromatography system, including an autosampler, with a Raman spectrometer,
representative synthetic mixtures of lysozyme and varying phosphate and citrate buffer systems
could be automatically generated and measured. The partial least squares models trained on this
dataset were successfully transferred to a dynamic ultrafiltration/diafiltration (UF/DF) process,
enabling the inline real-time monitoring of protein and buffer concentrations. Consequently, this
chapter provided the technical proof of concept for a cohesive analytical strategy spanning from
automated data acquisition to process-adjacent application.
Building upon these foundations, chapter 4 addresses the selective differentiation and quantification
of native proteins and their aggregates within a chromatographic environment. Using bovine serum
albumin (BSA) as a model system, controlled thermal stress studies and statistically designed mixing
series were conducted to identify spectral markers for the aggregation state independent of the
total protein concentration. These models were subsequently validated in dynamic bind-and-elute
anion-exchange chromatography (AEX) runs. A direct comparison between linear PLS models
and non-linear CNN architectures revealed that high predictive performance within controlled
training data does not necessarily correlate with robustness against real-world process fluctuations.
The chapter demonstrates that data-driven approaches enable reliable real-time prediction of
monomer and aggregate profiles in preparative chromatography, while simultaneously underscoring
the necessity of careful model selection regarding data availability and transferability.
To bridge the remaining gap between purely predictive models and physical process understanding,
a complementary hard-modeling approach was established in chapter 5. The focus was placed on the
amide I region of the Raman spectra, which is highly sensitive to secondary structure alterations but
is concurrently severely disrupted by salt-induced background drifts during chromatographic elutions.
A constrained pseudo-Voigt model was developed that utilizes an integrated background model
to mathematically separate salt-dependent influences from protein-specific signal contributions.
The resulting model-based mathematical descriptors, such as the shift in the center of gravity
of the amide I band, were successfully validated against quantitative offline reference data for
monomers and aggregates. This approach illustrates that hard modeling bridges a mechanistic
gap, delivering physically interpretable structural features directly from the active process without
relying exclusively on correlative patterns.
In its entirety, this dissertation thus links three complementary levels of modern process analytics:
Automated, reproducible data generation (chapter 3), robust, data-driven prediction of critical
quality attributes under realistic process conditions (chapter 4), and physically informed resolution
of complex spectral signals for mechanistic structural interpretation (chapter 5). The work demonstrates
that Raman-based process analytics for therapeutic proteins must go far beyond the mere
optimization of predictive accuracy alone. Only the deliberate interplay of process knowledge,
tailored preprocessing, and the conscious evaluation of the trade-off between data-driven flexibility and
physical transparency enables deeper process understanding. Consequently, this work provides an
essential contribution to the implementation of intelligent, interpretable, and robust PAT strategies
in biopharmaceutical downstream processing.