Process Development Tools for Cross-Flow Filtration in Biopharmaceutical Downstream Processing

In der modernen Medizin sind biopharmazeutische Proteine wichtige Substanzen für die Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten wie Lymphomen bzw. Hepatitis B. Diese Proteine haben eine komplexe Struktur, die eine biologische Synthese in Zellen erfordert, und ihre parenterale Verabreichung bedarf einer anschließenden Reinigung. Abschließend muss das Protein in einer Flüssigkeit formuliert werden, die eine gewisse Haltbarkeit und physiologische Verträglichkeit gewährleistet. Die Gewinnung des Proteins aus der Zellbrühe, die Reinigung und die Formulierung werden als downstream processing (DSP) bezeichnet. ... mehrJeder Prozessschritt im DSP wird mit einer Grundoperation durchgeführt, eine davon ist die Querstromfiltration (cross-flow filtration, CFF), auch bekannt als Tangentialflussfiltration (TFF). Bei der CFF werden die Proteine durch Größenausschluss von Verunreinigungen oder der umgebenden flüssigen Phase getrennt, wobei der Trennmechanismus im Idealfall von anderen Proteineigenschaften wie Ladung oder Hydrophobizität entkoppelt ist. Der Größenausschluss wird durch poröse Membranen realisiert. Im DSP biopharmazeutischer Proteine kann die CFF für die Zellseparation, die Reinigung und die finale Formulierung eingesetzt werden. Letztere besteht in der Regel aus einer Kombination von Pufferaustausch und Konzentrationserhöhung, die als Ultrafiltration/Diafiltration (UF/DF) bezeichnet wird. Im Vergleich zur herkömmlichen Normalstromfiltration wird der Zulaufstrom bei der CFF parallel zur Membranoberfläche gerichtet und das Filtrat dringt durch die Poren der Membran. Daher führt die CFF zu einer geringeren Anreicherung der zurückgehaltenen Spezies an der Membranoberfläche und somit zu schnelleren Prozessen und weniger konzentrationsabhängiger Aggregation. Trotz dieser Vorteile ist die Prozessentwicklung für die CFF mit einigen Herausforderungen verbunden: Diese sind zeit- und materialaufwändige Experimente, begrenzte Reinigungsleistung und Abweichungen der Ionenkonzentrationen vom Zielwert bei hohen Proteinkonzentrationen. Im DSP stehen mehrere Werkzeuge für die Prozessentwicklung und -optimierung zur Verfügung, zum Beispiel Prozessintegration, Hochdurchsatz-Screenings (high-throughput screenings, HTS), prozessanalytische Technologie (process analytical technology, PAT) und mechanistische Modellierung. Im Vergleich zu anderen Grundoperationen, wie zum Beispiel der Chromatographie, werden diese Werkzeuge jedoch nur selten für die CFF eingesetzt. Das Ziel dieser Arbeit war es, Lösungen für die genannten Herausforderungen zu finden, indem diese Werkzeuge in speziellen Fallstudien eingesetzt werden. Zudem war es Ziel dieser Arbeit, Erkenntnisse aus diesen Fallstudien zu gewinnen, um die Auswahl der Werkzeuge zur Entwicklung von CFF-Prozessen im biopharmazeutischen DSP zu erweitern.
In Kapitel 1 dieser Arbeit wird einen Überblick über DSP-Ansätze für die beiden in dieser Arbeit exemplarisch verwendeten Biopharmazeutika, virusähnliche Partikel (virus-like particles, VLPs) und monoklonale Antikörper (monoclonal antibodies, mAbs), gegeben. VLPs sind nicht-infektiöse virale Partikel, denen das virale Genom fehlt. Nicht-umhüllte VLPs bestehen aus Proteinuntereinheiten, die sich in der produzierenden Zelle spontan zu Kapsiden zusammensetzen. VLPs werden meist während des DSP zerlegt und neu zusammengesetzt, um ihre Homogenität, Stabilität und Immunogenität zu verbessern. Biopharmazeutische Anwendungen von VLPs sind Impfstoffe und potenzielle therapeutische Impfstoffe oder Vektoren für die Ein-schleusung anderer Moleküle. MAbs sind Immunglobuline, die aus vier kovalent gebundenen Proteinketten bestehen. Im Vergleich zu mAbs sind die meisten VLPs um mehr als eine Größenordnung größer in Durchmesser und Molekulargewicht. MAbs gehören zu den am häufigsten zugelassenen Biopharmazeutika für den menschlichen Gebrauch und finden unter anderem bei der Behandlung von Krebs- und Entzündungskrankheiten Anwendung. Außerdem werden in Kapitel 1 Grundlagen und Anwendungen der CFF erläutert. Abschließend werden Hintergrundwissen und aktuelle Forschung zu den angewandten Werkzeugen der Prozessentwicklung dargestellt.
Alternative Trennverfahren zur chromatographischen Reinigung weisen häufig eine geringere Trennleistung auf und sind schlecht skalierbar. Die wichtigsten Messgrößen für die Prozessleitung im DSP sind Reinheit und Produktivität. Beide können durch Prozessintegration verbessert werden, die durch die Kombination von Grundoperationen in einem gemeinsamen Arbeitsraum oder deren nahtlose Verbindung erreicht wird. In Kapitel 3 wird die Anwendung der Prozessintegration zur Verbesserung der Prozessleistung und der Skalierbarkeit des DSP von nicht-umhüllten VLPs vorgestellt. Dazu wurden die VLP-Fällung, -Wäsche und -Rücklösung mit CFF kombiniert. Es wurde eine Steuerung der Permeatflussrate implementiert, die die Verdichtung des Präzipitats an der Membranoberfläche reduzierte. Im Vergleich zur Abtrennung des Präzipitats mittels Zentrifugation, führte dieser Ansatz zu einer verbesserten Reinheit und Produktivität sowie zu einem höheren Automatisierungsgrad. Die Steuerung der Permeatflussrate ermöglichte auch die zusätzliche Integration von multimodaler Größenausschlusschromatographie (size exclusion chromatography, SEC) in den Rücklösungsstrom und damit eine weitere Verbesserung der Reinheit. Die in-line-Überwachung der Absorbanz von ultraviolettem Licht (UV) und die Produktfraktionierung wurden implementiert, um die Reinheit auf der Grundlage von datengesteuerten Entscheidungen während des Prozesses zu verbessern. Die vorgestellten Maßnahmen führten zu einem integrierten Abtrennungs- und Reinigungsschritt mit flexibler Skalierbarkeit und großem Potenzial für eine vollständige Automatisierung. Die Trennleistung war außerdem vergleichbar mit kompletten DSP-Ansätzen in der Literatur. Durch die Integration mehrerer Trenntechniken wurden Synergien geschaffen, die die Leistungsgrenzen der einzelnen Techniken überwinden. Der resultierende DSP-Ansatz basiert ausschließlich auf größenselektiven Trenntechniken, die den Größenunterschied von VLPs zu üblichen Verunreinigungen ausnutzen. Dieser Größenunterschied gilt für die meisten VLPs und verspricht somit eine breite Anwendbarkeit des vorgestellten DSP-Ansatzes.
In der biopharmazeutischen Entwicklung ist die Verfügbarkeit von Proteinmaterial oft begrenzt, während die CFF vergleichsweise große Mengen für experimentelle Studien benötigt. In Kapitel 4 werden diese Herausforderungen adressiert, indem ein Ansatz zur Prozessentwicklung für Proteinreaktionen, die durch eine Änderung der Flüssigphase angetrieben werden, vorgestellt wird. Als Fallstudie wurde die Zerlegung von nicht-umhüllten VLPs untersucht. Sie kann durch eine Änderung der Flüssigphase ausgelöst werden, zum Beispiel durch eine Erhöhung des pH-Werts und der Harnstoffkonzentration. Um die optimalen Flüssigphasenbedingungen für die Zerlegung von VLPs zu finden, wurden HTS in kleinen Volumina durchgeführt. Dazu wurden VLP-Lösungen mit Stammlösungen gemischt, um den Prozessbedingungen zu entsprechen, und unter Reaktionsbedingungen automatisch mittels SEC analysiert. Die daraus resultierenden hochauflösenden Daten ermöglichten die Charakterisierung der Zerlegung der VLPs im Hinblick auf die CFF-basierte Prozessierung. Die optimalen Bedingungen wurden dann in einem DF-Prozessschritt im Labormaßstab angewendet. Die nach der DF-basierten Prozessierung beobachtete höhere Ausbeute und Reinheit wurde auf eine kontrollierte Änderung der Flüssigphase, eine intensivere Durchmischung und die gleichzeitige Abreicherung von Verunreinigungen zurückgeführt. Darüber hinaus wurde der VLP-Zerlegungsschritt in eine Sequenz von filtrationsbasierten Prozess-schritten eingebettet, wodurch unerwünschte Spezies mit höherem Mole-kulargewicht deutlich reduziert wurden. Die ausschließliche Verwendung der Filtration als größenselektiver Trenntechnik macht den entwickelten Prozess unabhängig von anderen molekularen Proteineigenschaften und bietet daher das Potenzial für eine Plattformprozessierung von nicht-umhüllten VLPs im Allgemeinen. Der vorgestellte Ansatz zur Prozessentwicklung reduziert den Zeit- und Proteinbedarf durch die Entkopplung des Screenings der Bedingungen von der CFF-Entwicklung und bietet das Potenzial für eine umfassende Charakterisierung.
Die in Kapitel 5 vorgestellte Studie zielte darauf ab, die Herausforderung der Materialbeschränkungen zu überwinden, indem das aus CFF-Experimenten gewonnene Wissen maximiert wird. Dazu wurde ein PAT-Konzept für denselben Prozessschritt der Zerlegung von VLPs entwickelt, der in Kapitel 4 vorgestellt wird. Eine Reihe von PAT-Sensoren wurde unter verschiedenen Prozessbedingungen evaluiert. Parameter der Filtration wie Drücke, Durchflussraten und Pufferaustausch wurden in-line überwacht. Der Fortschritt der Zerlegung der VLPs wurde on-line mittels UV-Absorbanz und statischer Lichtstreuung qualitativ überwacht. Die Analyse der zweiten Ableitung der UV-Spektren zeigte außerdem Veränderungen in der Tertiärstruktur der Proteinuntereinheiten während der VLP-Zerlegung. Die on-line Überwachung der dynamischen Lichtstreuung zeigte Potenzial als qualitativer Indikator für unerwünschte Proteinaggregation. Regressionsmodelle, die UV-Daten als Eingangsgröße und die Konzentration der VLP-Untereinheiten als Ausgangsgröße verwenden, wurden kalibriert und anhand von at-line SEC-Daten als Referenz validiert. Mit Hilfe der Modelle wurden die Konzentrationen der Untereinheiten und damit der Fortschritt der VLP-Zerlegung präzise vorausgesagt. Die Vorhersagen wurden erfolgreich zur Erkennung von Prozessendpunkten eingesetzt. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass unverarbeitete univariate Signale von UV und statischer Lichtstreuung den Prozessendpunkt erfolgreich erkennen, was einen einfachen Ansatz für die großtechnische Herstellung darstellt. Insgesamt liefert das entwickelte PAT-Konzept prozess- und produktbezogene Daten in (nahezu) Echtzeit, was eine umfassende Überwachung, Charakterisierung und Endpunktdetektion ermöglicht. Der vorgestellte Ansatz hat großes Potenzial zur Charakterisierung der Zerlegung anderer VLPs oder von Reaktionen, die eine Veränderung der Partikelgröße oder der tertiären Proteinstruktur mit sich bringen.
Die Formulierung biopharmazeutischer Proteine mittels UF/DF wird mit steigender Proteinkonzentration anspruchsvoller. Die Anreicherung von geladenen Proteinen führt zu einer ungleichmäßigen Verteilung von geladenen Hilfsstoffen durch die Membran, was als Gibbs-Donnan-Effekt bezeichnet wird. Dieser Effekt führt zu Abweichungen des pH-Werts und der Konzentration der Hilfsstoffe von den Zielbedingungen. Diese Abweichungen können durch den Volumenausschlusseffekt oder die Abhängigkeit der pK-Werte von der Ionenstärke noch verstärkt oder verringert werden. Das komplexe Geflecht dieser voneinander abhängigen Phänomene erschwert einfache oder generische Abschätzungen der endgültigen Zusammensetzung. In Kapitel 6 wird die Entwicklung und Validierung eines mechanistischen Modells vorgestellt, das die genannten Phänomene und Wechselwirkungen beschreibt. Ziel der Studie war es, ein besseres Verständnis der Modellvariablen zu erlangen und die Zusammensetzung während UF/DF-Prozessen mit hohen Konzentrationen vorherzusagen. Derzeit verfügbare Modelle beschreiben und validieren den Bereich hoher Proteinkonzentrationen über 100 gL^{-1} nur unzureichend oder erfordern eine experimentelle Kalibrierung. Es wurde ein mechanistisches Modell entwickelt, das auf der Poisson-Boltzmann-Theorie und einem grundlegenden Stern-Modell basiert, um die elektrostatischen Wechselwirkungen von Proteinen und geladenen gelösten Stoffen zu beschreiben. Ein besonderer Fokus bei der Entwicklung lag auf hohen Proteinkonzentrationen. Das Modell wurde außerdem so konzipiert, dass als Eingangsvariablen lediglich üblicherweise bekannte theoretische Informationen über das Protein und die Pufferzusammensetzung benötigt werden. Das Modell wurde anhand umfassender experimenteller Daten kompletter UF/DF/UF-Sequenzen von mAbs und verschiedenen Flüssigphasenbedingungen sorgfältig validiert. Die Vorhersagen des Modells zeigten im Vergleich zu bestehenden Ansätzen eine bessere Genauigkeit im Bereich hoher Konzentrationen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das entwickelte Modell und die angewandte Validierungsstrategie ein tieferes Verständnis von UF/DF-Modellen, die auf der Poisson-Boltzmann Theorie basieren, ermöglichen. Das rein prädiktive Modell ermöglicht ein systematisches in silico Design von hochkonzentrierten UF/DF-Schritten, ohne dass Proteinmaterial benötigt wird.
Abschließend kann gesagt werden, dass Prozessintegration, HTS, PAT und mechanistische Modellierung erfolgreich für die Entwicklung von CFF-Prozessen implementiert und zur Verbesserung der Prozessleistung, des Proteinbedarfs und der Entwicklungszeiten eingesetzt wurden. Diese Arbeit liefert somit potenzielle Lösungen für die Herausforderungen in der biopharmazeutischen CFF-Prozessentwicklung auf der Grundlage von konkreten Fallstudien. Zusätzlich zu diesen Lösungen bieten die entwickelten CFF-Prozesse neue Ansätze für die größenselektive Aufreinigung von nicht-umhüllten VLPs und damit Bausteine für ein Plattform-DSP. Für die Modellierung der Zusammensetzung während der UF/DF von hochkonzentrierten mAb-Formulierungen wird ein umfassendes Verständnis der Modellvariablen und der Gültigkeit der Annahmen erarbeitet. Diese Arbeit zur Erweiterung des Forschungsstandes zur CFF-Prozessentwicklung durch fortschrittliche Entwicklungsansätze und Prozessdesigns bei.

In modern medicine, biopharmaceutical proteins are important substances for the treatment and prevention of diseases such as lymphoma and hepatitis B, respectively. These proteins have a complex structure that requires biological synthesis in cells and their parenteral administration requires subsequent purification. Finally, the protein has to be formulated in a liquid that provides a certain stability and physiological compatibility. Recovery of the protein from the cell broth, purification, and formulation are referred to as downstream processing (DSP). Each processing step in DSP is conducted by a unit operation, one of which is cross-flow filtration (CFF), also known as tangential flow filtration (TFF). ... mehrIn CFF, proteins are separated from impurities or the surrounding liquid phase by size-exclusion, ideally decoupling the separation mechanisms from other protein properties such as charge or hydrophobicity. Size-exclusion is realized by porous membranes. In DSP of biopharmaceutical proteins, CFF can be applied for cell separation, purification, and final formulation. The latter usually consists of a combination of buffer exchange and concentration increase, referred to as ultrafiltration/diafiltration (UF/DF). Compared to conventional normal-flow filtration, the feed stream in CFF is directed parallelly to the membrane surface and the filtrate penetrates the pores of the membrane. Therefore, CFF leads to less accumulation of retained species at the membrane surface and thus faster processes and less concentration-dependent aggregation. Despite these advantages, process development for CFF comes with several challenges, which are time- and material-consuming experiments, limited purification performance, and deviations of ion concentrations from the target at high protein concentrations. In DSP, several tools for process development and optimization are available, for example, process integration, high-throughput screenings (HTS), process analytical technology (PAT), and mechanistic modeling. However, these tools are only rarely applied to CFF when compared to other unit operations such as chromatography. The objective of this thesis was to provide solutions to the mentioned challenges through the implementation of these tools in dedicated case studies. Ultimately, this thesis aimed to gain knowledge from these case studies to extend the process development toolbox for CFF processes in biopharmaceutical DSP.
In Chapter 1 of this thesis, DSP approaches for the two biopharmaceuti-cals exemplarily used in this thesis, virus-like particles (VLPs) and monoclonal antibodies (mAbs), are reviewed. VLPs are non-infectious viral particles missing the viral genome. Non-enveloped VLPs are composed of protein subunits that spontaneously assemble into capsids in the producing cell. VLPs are often dis- and reassembled during DSP to improve their homogeneity, stability, and immunogenicity. Biopharmaceutical applications of VLPs are vaccines and potentially therapeutic vaccines or vectors for the delivery of other molecules. MAbs are immunoglobulins consisting of four covalently bound protein chains. Compared to mAbs, most VLPs are more than one order of magnitude larger in size and molecular weight. MAbs are one of the most frequently licensed biopharmaceuticals for human use with a variety of applications, including the treatment of cancers and inflammatory diseases. Furthermore, the principles and applications of CFF are discussed in Chapter 1. Finally, background information and current research on the applied process development tools are reviewed.
Alternative separation techniques to chromatographic purification often show lower purification performance and poor scalability. The main measures for DSP performance are purity and productivity. Both can be improved by process integration, which is realized by combining unit operations in a common space or their seamless connection. Chapter 3 presents the application of process integration to improve the process performance and scalability in the DSP of non-enveloped VLPs. Therefore, VLP precipitation, wash, and re-dissolution were combined with CFF. Permeate flow rate control was implemented and reduced the compaction of precipitate at the membrane surface. Compared to centrifugation-based precipitate separation, this approach led to improved purity and productivity as well as a higher degree of automation. Permeate flow rate control also facilitated additional integration of multimodal size-exclusion chromatography (SEC) into the re-dissolution stream to further improve purity. In-line ultraviolet light (UV) absorbance monitoring and product fractionation were implemented to improve purity based on data-driven in-process decisions. Ultimately, the presented approaches led to an integrated capture and purification step with flexible scalability and great potential for full automation. Purification performance was also comparable to entire DSP approaches in literature. The integration of multiple separation techniques created synergies, overcoming the limitations of the individual techniques. The resulting DSP approach is based only on size-selective separations exploiting the size difference of VLPs and common impurities. This size difference applies to most VLPs and thus promises a wide applicability of the presented DSP approach.
In biopharmaceutical development, the availability of protein material is often limited whereas CFF requires comparably large amounts for experimental studies. In Chapter 4, these challenges are addressed by presenting a process development approach for protein reactions driven by a change in liquid phase conditions. As a case study, the disassembly of non-enveloped VLPs was investigated. It may be induced by a change in liquid phase conditions, for example by increasing pH and urea concentration. Low-volume HTS were applied to find the optimal liquid phase conditions for VLP disassembly. Therefore, VLP solutions were mixed with stock solutions to match the process conditions and automatically analyzed by SEC under reaction conditions. The resulting high-resolution data allowed for characterization of the VLP disassembly reaction with regard to CFF-based processing. Optimal conditions were then applied in a laboratory-scale cross-flow DF process step. Higher yield and purity observed after DF-based processing were attributed to a controlled change of liquid phase conditions, intensified mixing, and the simultaneous depletion of impurities. Moreover, the disassembly step was embedded in a sequence of filtration-based processing steps which markedly reduced undesired higher molecular weight species. Employing only filtration as a size-selective technique makes the developed process independent of other molecular protein properties and therefore offers the potential for platform processing of non-enveloped VLPs in general. Ultimately, the presented process development approach reduces time and protein material requirements by decoupling the condition screening from CFF development and offers the potential for thorough characterization.
The study presented in Chapter 5 aimed to overcome the challenge of material limitations by maximizing the knowledge gained from CFF experiments. Therefore, a PAT framework was developed for the same VLP disassembly process step that is presented in Chapter 4. An array of PAT sensors was evaluated under varying processing conditions. Filtration performance parameters such as pressures, flow rates, and buffer exchange were monitored in-line. VLP disassembly progress was qualitatively traced by on-line UV absorbance and static light scattering spectroscopy. The second derivative analysis of the UV spectra further revealed changes in the tertiary structure of subunit proteins during disassembly. On-line monitoring of dynamic light scattering showed potential as a qualitative indicator of undesired protein aggregation. Regression models using UV data as input and VLP subunit concentration as output were calibrated and validated using at-line SEC data as a reference. Using the models, the subunit concentrations and thus the disassembly progress was accurately predicted. Predictions were successfully applied for process endpoint detection. In addition, univariate raw signals of UV and static light scattering were found to successfully detect the process endpoint providing a simple approach for large-scale manufacturing. Overall, the developed PAT framework provided process- and product-related signals in (near) real-time enabling comprehensive monitoring, characterization, and endpoint detection. The presented approach has great potential to characterize the disassembly of other VLPs or reactions involving a change in particle size or tertiary protein structure.
Formulation of biopharmaceutical proteins by UF/DF becomes increasingly challenging with increasing protein concentration. The accumulation of charged proteins leads to an uneven distribution of charged excipients across the membrane, referred to as Gibbs-Donnan effect. This effect leads to deviations in pH and excipient concentrations from target conditions. These deviations may be further enhanced or reduced by the volume exclusion effect or the ionic strength dependency of pK values. The complex network of these interdependent phenomena makes simple or generic estimations of the final composition difficult. In Chapter 6, the development and validation of a mechanistic model describing the mentioned phenomena and interactions are presented. The study aimed to provide a better understanding of model variables and predict the composition during high-concentration UF/DF processes. Currently available models describe and validate the high-protein-concentration regime above 100 gL^{-1} only insufficiently or require experimental calibration. A mechanistic model based on Poisson-Boltzmann theory and a basic Stern model was developed to describe the electrostatic interactions of proteins and charged solutes. A particular focus during development was on high protein concentrations. The model was also designed to require only usually known theoretical information on the protein and buffer compositions as input variables. The model was thoroughly validated with comprehensive experimental data of entire UF/DF/UF sequences of mAbs and multiple liquid phase conditions. Model predictions showed better accuracy in the high-concentration regime compared to existing approaches. In conclusion, the developed model and the applied validation strategy provide a deeper understanding of UF/DF models using Poisson-Boltzmann theory. The purely predictive model enables systematic in silico design of high-concentration UF/DF steps without requiring any protein material.
In summary, process integration, HTS, PAT, and mechanistic modeling were successfully implemented for CFF process development and applied to improve process performance, protein material requirements, and development timelines. This thesis thereby provides potential solutions to challenges in biopharmaceutical CFF process development based on dedicated case studies. In addition to these solutions, the developed CFF processes offer new approaches for size-selective purification of non-enveloped VLPs and thus building blocks for platform DSP. For modeling the composition during UF/DF of highly concentrated mAb formulations, a thorough understanding of model variables and the validity of assumptions is provided. This thesis contributes to the expansion of scientific knowledge on CFF process development through advanced development approaches and process designs.